Rapid fabrication of biomimetic PLGA microsphere incorporated with natural porcine dermal aECM for bone regeneration

（ESASE法快速制备含ECM的PLGA微载体并用于骨再生－Regenerative Biomaterials）

　　由疾病或创伤引起的大型骨缺损因其修复困难而成为骨科的一大临床挑战[1,2]。每年进行200多万例骨移植手术，到2026年，骨支架和替代品的全球市场规模将达到42.9亿美元[3,4]。临床骨缺损修复的金标准是自体骨移植，但供体来源有限、继发性损伤和感染风险限制了自体骨移植的应用[5,6]。因此，基于各种生物材料的人工骨替代品引起了越来越多的关注[7-9]。此外，由于缺损特征的不规则形状，大骨缺损难以修复[10,11]。因此，迫切需要设计和开发新的骨替代品，用于骨科的实验研究和临床应用。理想骨替代物的特征应该是骨传导性和骨诱导性[12-14]。它们还应该能够支持细胞粘附、生长和细胞外基质（ECM）的形成[15]。

　　最近，作为一种新型的球形支架材料，具有生物功能的微球在骨组织工程中受到了广泛的关注[16,17]。与其他类型的支架相比，微球的特点是为细胞生长提供高比表面积，并保持分化的细胞表型[18,19]。它们可以作为构建支架的基本构建块，它们之间的微米级间隙可以允许氧气和营养物质进入，同时支持细胞生长[17]。目前，制备微球最常用的方法包括乳液法[20,21]、喷雾干燥法[22,23]、微流体法[24,25]和电流体动力学（EHD）喷雾技术[26,27]。通过乳液和喷雾干燥法制备的微球不均匀，需要进一步筛选。此外，整个准备过程需要很长时间。虽然微流控方法具有良好的均匀性，但微流控方法的装置很复杂。此外，这种方法操作繁琐，成本高昂，制备效率低。EHD喷涂技术基于两个带电电极之间的高压静电场原理，产生射流以制造液滴[28]。在水溶性溶剂的情况下，将聚合物溶液注入接收器会导致N-甲基吡咯烷酮（NMP）快速扩散到接收到的溶液中。溶液立即淬灭并引发聚合物固化[29]。这种方法操作简单，可以通过调整各种参数，包括介质特性（如浓度/粘度、电导率）和施加电压，以受控的方式连续制备尺寸均匀和可定制的微球[30-32]。

　　聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种共聚物，是一种有前景的可生物降解生物材料，已获得美国食品药品监督管理局的批准[33,34]。聚合物显示出良好的弹性机械性能，降解速率可以调节[35]。然而，生物惰性严重限制了其生物应用[36]。为了克服这些障碍，许多生物活性无机或有机材料已被合成或修饰到PLGA上，如羟基磷灰石[37-39]、生长因子[40-42]、ECM[15,43,44]等。其中，ECM富含胶原蛋白，是细胞生长的微环境，从而通过调节细胞功能来调节组织再生，目前广泛应用于组织工程和生物材料[45]。然而，ECM的机械性能较差，通常需要复合聚合物材料来提高机械性能[46]。Zhou等人[15]利用脱细胞技术在PLGA微球表面生成衍生ECM，以达到提高微球表面生物活性的目的。通过这种方式，ECM的微观结构可以得到很好的保护，以最大限度地发挥ECM的作用。Pathak等人[47]通过希夫碱反应将ECM化学接枝到PLGA上，以提高其表面生物活性。这种方法允许aECM牢固地附着在PLGA表面上，具有可控的切割，但化学方法操作复杂，存在安全风险。Kim等人[48]直接将胶原蛋白和PLGA混合，以提高材料的抗炎和成骨性能。这种方法可以简单有效地结合胶原蛋白和PLGA，并发挥一定的抗炎和成骨功能，但它是ECM的单一成分，没有ECM的微观结构。因此，利用微观结构完整的ECM和开发更简单的制备方法是非常必要的。在这项研究中，我们使用了来源于猪皮且无免疫原性的aECM。此外，在这项工作中，ECM和PLGA是通过使用EHD喷雾和溶剂萃取（ESASE）技术驱动的固化进行简单混合而复合的，这是一种耗时短、成本高的过程。

　　本研究采用ESASE技术快速制备了aECM/PLGA微球。本研究对PLGA溶液的电压和浓度进行了研究。随后，制备了不同aECM含量的仿生aECM/PLGA微球，并通过SEM和天狼星红染色观察了微球表面形态和aECM在微球表面的分布。通过体外评估，aECM/PLGA微球可以促进MC3T3-E1的粘附和成骨分化。大鼠颅骨缺损实验表明，生物活性微球可以促进骨缺损的恢复。通过微球的检测和体内外实验，开发了一种快速方便的制备生物活性微球的方法，并在骨组织工程中显示出广阔的应用前景。

结果与讨论

1、微球的制备与形貌

为获得理想的微球尺寸和形貌，研究了溶液浓度、电压和aECM含量的影响。

（1）溶液浓度的影响

如图1所示，当PLGA的浓度为5%时，微球呈不规则球形和彗星形，带有小尾巴。实验结果与报道的文献一致，这意味着粘度过低的聚合物液滴在反相溶剂中固化成颗粒时会产生拖尾[52]。随着浓度的增加，微球变成规则的球体。此外，直径随着浓度的增加而增加。7%组和9%组的平均直径分别为271.04±34.41和341.24±63.82μm。随着浓度的增加，尺寸分布的范围变宽。微球在5%的浓度下存在小拖尾。原因可能是粘度太低，液滴变形。Li等人[30]在制备聚碳酸酯微球时观察到了这一现象。Lin等人[52]在制备海藻酸盐微球时报道了这一现象。这些结果表明，在使用抗溶剂替代聚合物溶液的过程中，浓度过低会导致球度不规则并产生拖尾现象。结果表明，PLGA/NMP溶液在不同浓度下的动态粘度随浓度变化很大。5%和7%PLGA/NMP溶液的动态粘度分别为117和355mPa·s。7%PLGA/NMP溶液的动态粘度增加到1073.6 mPa⋅s。随着浓度的增加，溶液的粘度增加，液滴的强度增加，滴的球形形状更加稳定，更容易形成球形度良好的液滴，这也与文献[30,52]中报道的一致。当PLGA的浓度为7%时，可以制备出更球形、尺寸更均匀的微球。在此，下一制造工艺将使用7%的PLGA浓度。

Figure1.The morphology of microspheres fabricated at the concentration of 5%, 7%, 9%of PLGA and all the length of the scale of 250μm. The statistical size distribution ofmicrospheres 7% group and 9% group. N=35. The dynamic viscosity of PLGA/NMPsolutions at different concentrations.

（2）电压的影响

研究了4.5至7.5 kV电压对PLGA微球直径的影响。图2显示了4.5至7.5 kV电压下微球尺寸的照片和变化。随着静电场电压的增加，微球尺寸显著减小。对于4.5和5.5 kV的电压，发现微球的直径分别为1112.30±259.955和924.18±115.4μm。由于施加在液滴上的静电力太低，液滴无法喷射，只能下落，直到重力大于表面延伸。正如Andreu等人[53]所报道的那样，当电压增加时，电荷会积聚，溶液会因电场力的作用而破裂并分裂成小液滴。因此，液滴的直径变小。微球直径分布在433.23±55.92和123.53±19.87μm之间，电压在5.5和7.5之间正如文献报道的那样，在骨修复微球的最佳曲率下，F-actin细胞骨架的形成、核变形和Lamin A的表达显著增强[25]。因此，在7.0 kV电压下制备的微球最符合要求，相应尺寸为205.05±47.30μm。

Figure2.Appearance of PLGA microspheres prepared at different voltages (5.5, 6.0,6.5, 7.0, 6.5kV),and the average diameters of different microspheres. All the scale bars are 500μm. N=25 *P<0.05.

（3）aECM含量

使用上述最佳PLGA浓度为7%和最佳电压为7 kV的参数，通过ESASE制备了含有不同量aECM的不同微球。aECM和胶原蛋白的微观结构如图3A所示，aECM为颗粒状，胶原蛋白主要为纤维状。图3B显示了微球的制备，aECM粉末均匀分散在PLGA/NMP溶液中，然后通过ESASE方法制备成微球。1克aECM/PLGA微球从aECM粉末固化成微球只需要大约30分钟。通过脱细胞技术在微球表面生成衍生的aECM通常需要提前在材料表面培养细胞10-14天，这非常耗时[54-56]。此外，脱细胞过程复杂而繁琐[57]。喷雾干燥法也需要至少1.5小时，溶剂蒸发法需要5小时[58]。相比之下，ESASE是一种快速制备aECM/PLGA微球的方法。从图3C可以看出，随着αECM的加入，微球仍然可以保持球形。尺寸可以均匀控制。不同aECM/PLGA的尺寸如补充图S1所示。微球的直径与动态粘度呈正相关。各组中最小直径为PLGA微球，最大直径为50aECM/PLGA微球。最小和最大直径分别为202.21±15.08和212.72±16.72μm。所有组别均满足最佳直径的要求。如补充图S2所示，aECM/PLGA/NMP悬浮液的动态粘度在355至634 mPa⋅s之间变化。天狼星红染色具有aECM胶原的特异性反应，可以将aECM染成红色。如图3C所示，aECM暴露在微球表面。随着aECM含量的增加，暴露的aECM越多。如图3D所示，PLGA、1aECM/PLGA和5aECM/PLGA微球表面光滑，微球内部有大量孔隙。孔的尺寸从中心到表面逐渐减小。这一现象与Yan等人[1]的文献报道一致。主要原因是PLGA/NMP滴入乙醇溶液，然后NMP被乙醇溶液吸收，而PLGA沉淀并留下大量通道供NMP溶解到溶液中，然后当微球冻干时，通道变成孔隙。另一方面，随着aECM含量的增加，微球表面变得粗糙（25-50aECM/PLGA组和25Col/PLGA组合）。1-10aECM/PLGA组保持平稳。微球切片的EDS光谱表明存在aECM，因为光谱中发现了N的信号。通过微球的Sirus红染色和微球横截面的EDS，可以在微球的表面和内部观察到aECM。aECM暴露的粗糙表面表明仿生微球已成功制备。

Figure3.(A) SEM of aECM and collagen. (B) Rapid fabrication of microspheres, (1)stepper motor controller, (2) extruder, (3) collecting device, (4) high voltageelectrostatic generator. (C) Micrographs and the staining of sire red ofdifferent microspheres containing different amounts of aECM. The bars of the micrographsare 250μm and the bars of sire red staining are 100μm. (D) Morphology and cross-section ofmicrospheres and EDS of microspheres. The bars of morphology of 250× andcross-section are 50μm. The bars of morphology of 500× are 100μm.

4、细胞增殖和荧光细胞染色结果

为了观察细胞增殖情况，使用CCK-8评估细胞状况。进行钙黄绿素AM/PI染色以评估细胞存活率，结果如图4所示。从图4A中可以看出，在第1天的所有测试条件下，细胞粘附没有差异。然而，在第3天和第7天，与PLGA和1-10aECM/PLGA组相比，25-50aECM/PLGA组的MC3T3-E1细胞显著增加。图4B所示的钙黄绿素/PI证实了这些结果，显示在第3天和第7天，这些组的微球表面粘附的细胞模式更高。在第7天，细胞增殖的增加非常明显，特别是在50ECM/PLGA组，这意味着ECM和诱导粗糙度增加了细胞粘附和增殖。aICM的量对细胞粘附有显著影响。Pathak等人[47]报告称，胶原蛋白也有助于细胞粘附，因为胶原蛋白是一种典型的细胞粘附，分布在其分子链上的大量精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）序列为细胞粘附提供了活性位点。Zhou等人[15]证明，aECM可以帮助细胞的粘附和增殖，因为aECM含有粘附蛋白并提供细胞的微环境。Diener等人[59]证实，粗糙表面更有利于细胞粘附，粗糙表面有利于局部粘附形成、整合素聚集和局部粘附迁移。在这项研究中，当aECM含量低于5%时，微球光滑，导致细胞粘附不良。随着aECM含量的增加，随着仿生微球表面的粗糙和aECM在微球表面暴露的越多，细胞粘附和增殖能力增强。此外，与25aECM/PLGA相比，25Col/PLGA的结果显示细胞增殖值较低。这一结果可能是由ECM中除胶原蛋白外的其余成分的影响引起的。

Figure4.(A) CCK-8 test of the proliferation of MC3T3-E1 on the PLGA and aECM/PLGAmicrospheres for 1, 3 and 7days; n=3. *P<0.05. (B) Micrographs of the adhesion andgrowth of MC3T3-E1 on the PLGA and aECM/PLGA microspheres at 1, 3 and 7days stained with calcein-AM/PI. All scalebars are 250μm.

碱性磷酸酶（ALP）活性评价

ALP活性在成骨细胞分化前显著增加，是成骨分化的重要指标[41]。aECM具有提供细胞ALP活性和诱导分化为成骨细胞的作用[15,60]。图5A显示，在培养7天和14天后，aECM/PLGA微球的ALP活性值高于PLGA微球，这得到了染色结果的证实。这表明aECM还增加了MC3T3-E1的活性，并显示出分化为成骨细胞的潜力。此外，PLGA和50aECM/PLGA微球之间的差异具有统计学意义。在培养7天和14天时，50aECM/PLGA微球的ALP活性分别比PLGA微球高5.3倍和2.6倍。图5B显示了MC3T3-E1s在仿生微球表面上的ALP染色。50aECM/PLGA微球的染色比7天时aECM含量低于5%的微球更暗。培养14天后，各组染色加深，尤其是50aECM/PLGA组，与定量结果一致。结果表明，aECM和PLGA的组成可以有效提高MC3T3-E1的ALP活性，并可能促进体外骨形成能力的增强。

Figure 5.(A)The activity ofcorresponding ALP quantitative evaluation analysis. The scale bars are 250μm. *P<0.05.(B) The ALP staining of MC3T3-E1 cells cultured ondifferent microspheres for 7 and 14 days.

茜素红染色和钙沉积检测材料生物矿化能力

　　钙沉积是成骨分化的重要指标。ARS和钙定量是表征不同微球上前成骨细胞成骨分化的有效方法[1]。使用10%CPC提取ARS结节，并测量钙沉积，从而定量评估不同微球的骨矿化能力。如图6A所示，50aECM/PLGA组的总钙含量在14天和21天时最高。在14天时，25aECM/PLGA和50aECM/PLGA组显著高于PLGA和1aECM/PLGA组。在14天时，25aECM/PLGA和50aECM/PLGA之间存在轻微差异，而在21天时，50aECM-PLGA的钙含量显著高于25aEMC/PLGA组。各组的钙含量在21天时随着ECM含量的增加而增加，这意味着aECM的含量会影响钙沉积。在21天时，25aECM/PLGA和50aEMC/PLGA组的钙含量显著高于其他组。不同的ECM物种对成骨分化的影响不同[60]。在这项研究中，还观察到25aECM/PLGA组的钙含量高于25Col-PLGA组。图6B显示，PLGA、1aECM/PLGA、5aECM/PLGA-和10aECM/PLGA--微球有轻微染色。然而，含有25aECM/PLGA、50aEMC/PLGA和25Col/PLGA微球的MC3T3-E1细胞在14和21小时后均显示出强烈的红色结节染色天，表明高aECM/PLGA微球诱导的钙沉积优于低aECM/PLGA微球诱导。大量AR结节分布在aECM/PLGA微球上，证实含有aECM成分的微球在21天后显著促进了钙沉积，组间差异与14天后相似。50aECM/PLGA组钙结节的染色强度明显高于其他组，微球表面覆盖着大量钙染色结节。此外，25aECM/PLGA组显示的钙染色结节比25Col/PLGA组多。上述结果表明，25aECM/PLGA和50aEMC/PLGA微球具有更强的成骨分化和钙沉积能力，aECM的促进作用优于单独使用胶原蛋白。

Figure 6.(A) Corresponding quantitativeevaluation of calcium content mineral deposition of MC3T3-E1 cells cultured ondifferent microspheres after 14 and 21days. *P<0.05(B) ARS of MC3T3-E1 cells cultured on differentmicrospheres after differentiation for 14 and 21days. All the barsare 100μm.

实时定量PCR检测成骨相关基因的表达水平

　　通过实时定量PCR分析了MC3T3-E1s中四种成骨相关基因（OPN、Runx2、OCN和Col-I）的表达水平，这些基因与aECM/PLGA微球和相应的对照PLGA一起培养了7天和14天，结果总结在图7中。细胞粘附、增殖和分化受不同基因的调节[61]。体外实验表明，aECM/PLGA微球可以获得足够数量的前成骨细胞，并表现出很强的ALP活性和钙沉积能力。然而，接种后对细胞分化和增殖的影响尚不清楚。Runx2在分化早期表达。中期后可见OPN表达，晚期分化时可见OCN表达。Col-I基因首先在ECM生产的初始阶段表达[2,61]。如图7所示，培养7天后，50aEMC/PLGA微球组Runx2和OPN的表达水平高于PLGA微球组，25aECM/PLGA、50aEMC-PLGA和25Col/PLGA三个微球组OPN表达与aECM含量低于10aECM/PLGA的微球组相比有显著差异。此外，25aECM/PLGA微球组OPN的表达水平高于25Col/PLGA组，表明aECM可能比胶原蛋白具有更好的调节作用。含有少量aECM的微球上OCN的表达水平相似。对于Col-I，7天后25aECM/PLGA、50aECM/PLGA和25Col/PLGA显著高于其他组。14天后，50aECM/PLGA微球组与其他组的Runx2和OPN差异减小，组间差异无统计学意义。然而，50aECM/PLGA组的OPN表达水平仍显著高于单独使用PLGA的对照组。14天后，各材料组中OCN和Col 1的表达水平显著升高。天然骨基质富含胶原蛋白（主要是I型胶原蛋白）。OCN被视为骨形成的标志物，因为它是在成骨基质成熟过程中表达的一种特异性蛋白质。实时PCR的结果显示，25aECM/PLGA和50aECM/PLGA微球组骨特异性成熟基因OCN和Col-1的表达水平显著高于其他组，表明25aECM-PLGA和5aECM/PLGA微球具有促进成骨细胞分化和骨形成的能力。结果显示，Runx2、OPN和Col-1在早期表达，MC3T3-E1开始分泌胶原基质，Runx2的表达上调并介导成骨分化。细胞开始分化为成骨细胞，成骨标志蛋白OPN的基因表达水平升高。14天后，Runx2的表达几乎不明显，而晚期发育标志物OCN的表达显著上调，Col-1的表达也与PLGA组相比上调。aECM/PLGA微球的促骨作用在基因水平上得到了证实，这与成骨过程中标志蛋白的表达程序是一致的。通过比较50aECM/PLGA微球组与10aECM/PLGA、5aECM/PLGA、1aECM/PLGA/PLGA和PLGA组之间标记基因的表达水平，可以看出富含ECM的微球的成骨水平明显高于低aECM含量和无aECM的微球。因此，aECM/PLGA微球上基因表达水平的增加可能是由于aECM的生物活性。从25aECM/PLGA微球组和25Col/PLGA微微球组的比较可以看出，具有多组分和微结构的aECM微球的成骨水平明显高于纯胶原微球。这意味着aECM比纯胶原蛋白更能促进细胞的成骨分化。

Figure 7.MC3T3-E1 cells were cultured on the differentmicrospheres for 7 and 14days (control: plate culture, a: PLGA, b: 1aECM/PLGA, c:5aECM/PLGA, d: 10aECM/PLGA, e: 25aECM/PLGA, f: 50aECM/PLGA, g: 25Col/PLGA). Theexpression of four osteogenic genes (Runx2, OCN, OPN and col-1) was analyzed byqRT-PCR. The intensity of each gene was normalized to the value of GADPH. *P<0.05.

体内植入骨再生评价

体外实验表明，50ECM/PLGA微球具有促进细胞分化为成骨细胞的最佳功能。进一步研究了微球对颅骨缺损大鼠骨修复的影响。如图8A所示，在重建图像上可以清楚地观察到骨缺损区域。术后立即进行骨缺损的显微CT扫描，0W照片显示大鼠颅骨有一个直径为5mm的圆形缺损。术后4周，50aECM/PLGA组的新骨形成量明显高于其他组。术后8周，空白组仍有较大的未闭合缺损，25Col/PLGA组未闭合缺损面积较小。然而，在PLGA、25aECM/PLGA和50aEMC/PLGA组中，新骨几乎完全闭合了骨缺损。测量再生骨组织的骨体积/组织体积（BV/TV）比、小梁数量（Tb.N）、小梁厚度（Tb.Th）和小梁间距（Tb.Sp），以定量评估骨修复效率。手术后4周和8周的结果如图8B所示。结果显示，在第4周时，PLGA组的BV/TV（28.05±0.58%）比空白组（12.17±1.01%）高2.33倍，在第8周时，PL GA组的BV/TV（36.55±0.61%）比空白对照组（19.71±2.77%）高1.89倍。尽管PLGA是一种生物惰性材料，但它可以为骨细胞的生长和迁移提供支持，以促进骨修复。在第4周，25aECM/PLGA组的BV/TV（41.67±2.91%）比25Col/PLGA组合（39.75±1.02%）高1.04倍，在第8周，25aICM/PLGA组合（67.55±3.16%）比25Col/PLGA集团（51.91±1.54%）高1.30倍。生物活性材料的加入极大地促进了骨修复的效果。同时，aECM的促进作用强于纯胶原蛋白。此外，50aECM/PLGA组的BV/TV值为47.57±1.14%。8周后，50aEMC/PLGA的BV/TP值为72.92±2.19%。此外，Tb的值。Th和Tb。50aECM/PLGA组的N值显著高于其他四组，Tb值也显著高于其他三组。50aECM/PLGA的Sp在所有组中最低。这些结果表明，50aECM/PLGA组的修复效果最好。总体而言，3D重建图像和定量分析结果表明，微球可以帮助骨修复，50aECM/PLGA微球具有最佳的骨形成效果。此外，含有aECM的微球的修复效果强于含有胶原蛋白的微球，这与体外细胞实验的结果一致。

Figure 8.(A) Preparation for surgery. (B) Perform the surgery. (C) The calvarialdefects (the defect size is 5mm). (D) The implant ofmicrospheres at the defect. (E) Postoperation ofrats. (F) 3D reconstructed micro-CT images of bone formationat the rat calvarial bone defect areas at 0, 4 and 8weeks. (G) The quantitative micro-CT bone parameters of bonevolume/tissue volume (BV/TV) ratio, trabecular number (Tb.N), trabecularthickness (Tb.Th), trabecular separation (Tb.Sp) after 4- and 8-week postimplantation. *P<0.05.

修复区域的组织学分析

如图9所示，8周后，可以观察到微球内部有大的裂纹，一些微球已经损坏，这可能是由于微球在体内降解造成的。然而，PLGA没有完全降解，微球仍保持球形，可以清楚地观察到微球的内部松散多孔结构。在H&E染色图片中，细胞核被染成蓝色，细胞质和ECM被染成不同程度的红色。在空白组中，组织结构松散，没有出现典型的骨结构。在PLGA组中，组织和微球之间存在一定的间隙，但aECM/PLGA和Col/PLGA微球与周围组织紧密相连。作为一种惰性材料，PLGA与组织的亲和力较低。添加aECM和胶原蛋白可以提高微球的组织相容性。当以20倍的视野观察微球和组织时，少量细胞附着并规则排列在PLGA微球的表面上，但在微球内没有发现细胞和组织染色的痕迹。在aECM/PLGA微球和Col/PLGA微珠的表面，大量细胞有序排列，微珠内部也有细胞和组织染色，细胞浸润到微珠内部，表明生物活性微球中的细胞迁移能力较好。此外，与25aECM/PLGA组相比，50aECM/PLGA组有更多的内部细胞和更多染色的细胞质和基质成分，表明aECM含量对细胞迁移和生长有影响，aECM含量较高的微球对微球内的细胞迁移和增长有更好的影响。还观察到，与25Col/PLGA组相比，25aECM的表面和内部细胞更多，染色颜色更深，表明细胞迁移和生长更好。Masson三色染色被用作胶原纤维的特异性染色方法，以进一步评估骨组织的形成和成熟。胶原组织被染成蓝色，随着胶原组织的成熟，蓝色会变深。从图9中可以看出，每组微球之间都观察到规则的蓝色胶原束，填充25aECM/PLGA和50aEMC/PLGA微球的骨缺损中的胶原含量明显高于单独填充PLGA微球的骨缺陷，这可能与成骨的发生有关。此外，在25aECM/PLGA、50aEMC/PLGA和25Col/PLGA组中观察到大量成熟致密骨组织。50aECM/PLGA组更能吸引新组织在微球之间生长，这反映了aECM/PLGA微球周围大量新骨形成的可能性。在高倍镜下观察时，PLGA组的微球没有染色。在25aECM/PLGA、50aEMC/PLGA和25Col/PLGA微球内发现了由黑色箭头指向的蓝色染色组织，表明微球内形成了新的胶原蛋白。在骨缺损区域，成骨细胞的募集和迁移首先发生[62-64]。aECM为细胞生长和粘附提供了合适的微环境[65]。当成骨细胞被招募并迁移到缺陷区域时，暴露在25aECM/PLGA和50aEMC/PLGA微球上的aECM可以有效地粘附细胞并促进细胞增殖。如图6和图7所示，aECM/PLGA微球可以促进钙沉积并诱导细胞分化为成骨细胞。缺损的成骨作用显著增强。骨修复过程中的矿化和胶原蛋白沉积是骨修复的基础[66]。H&E染色和Masson染色显示50aECM/PLGA微球周围有明显的胶原沉积，表明成骨效果更好。25aECM/PLGA微球的修复效果优于25Col/PLGA。这可能表明，本研究中使用的aECM比单一胶原蛋白成分更有效地促进骨生成。结合之前的研究结果，体内实验可以证明aECM/PLGA微球具有良好的促进骨形成的作用，是一种有前景的骨组织工程材料。

Figure 9.H&E staining and Masson trichrome staining inoperative site at 8weeks. MS, microspheres. The scale bars of 5× and 20× are 200 and 50μm, respectively.

进一步评估了微球的生物安全性。如图10所示，各组心脏组织结构均显示典型的心肌细胞排列，具有明显的纤维结构，心肌细胞之间紧密相连，形成纵横交错的网状结构。此外，细胞形态学显示，小鼠心肌细胞呈长条状，有分支和突起，细胞内可见明显的水平条纹和线粒体等器官结构。在对各组肝组织进行切片检查时，观察到中央静脉位于每个肝小叶的中间，肝细胞呈放射状排列在中央静脉周围。脾红髓与白髓分界清晰，各组间无差异。在肺的分析中，肺泡隔富含毛细血管、结缔组织和单核细胞。各组肾组织切片显示肾小球、肾小管等结构清晰可见，病变细胞形态无明显异常或正常，细胞核形状和细胞质数量无明显不规则。组织结构完整，切片中肾小球、肾小管等组织结构完整无破损或丢失。结果表明，所有微球均未对体内主要器官产生毒性作用。

Figure10（略）

结论

本研究采用ESASE方法快速制备了含有天然猪皮aECM的生物活性PLGA微球。制备的微球显示出均匀的形态，暴露的aECM产生了一个仿生表面，可以为细胞粘附和细胞生长提供微环境。此外，体外实验表明，aECM/PLGA微球的ALP活性增强，50aECM/PLGA微球的碱性磷酸酶活性是PLGA微球的2.6倍。50aECM/PLGA微球具有比PLGA微球更强的钙沉积能力，表明aECM/PLGA具有成骨诱导分化的功能。动物实验中的显微CT和组织学分析结果表明，aECM/PLGA微球在术后4周和8周表现出更好的大鼠颅骨愈合效果和较低的免疫原性，50aECM/PLGA的BV/TV值分别为47.57±1.14%和72.92±1.14%2.19%, 分别。根据上述结果，可以得出结论，含有aECM的可生物降解PLGA微球是一种有前景的骨组织工程新型材料。

基金资助

本研究得到了国家自然科学基金（52173146和52203197）、军事后勤开放研究重点项目（No.BLB20J011）和吉林省科技发展计划（20240305051YY）的支持。

参考文献：略

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