1、g-HAP/PLGA-溶液浇铸成型（Bioamaterials,2009）

中英文摘要

在我们之前的研究中，表面接枝聚左旋乳酸（PLLA）的羟基磷灰石（HAP）（g-HAP）纳米复合材料因其界面相容性、力学性能和生物相容性的提升，在骨固定材料中显示出广阔的应用前景。本文采用溶剂浇注/颗粒浸出法制备了g-HAP/聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）三维多孔支架，以探究其在骨替代和组织工程中的应用。未接枝HAP/PLGA和纯PLGA复合物作为对照组。通过肌肉内植入和修复兔桡骨缺损的置换术，研究了其体内矿化和成骨情况。表面改性后，观察到g-HAP/PLGA支架中g-HAP颗粒分布更加均匀，但g-HAP/PLGA表面的钙暴露量降低。肌肉内植入研究表明，g-HAP/PLGA支架比PLGA支架更稳定，且在术后12~20周表现出与HAP/PLGA相似的矿化和生物降解性。修复临界桡骨缺损的植入研究表明，g-HAP/PLGA支架表现出快速且强烈的矿化和骨传导性，且BMP-2的掺入可增强复合植入物的成骨过程。g-HAP/PLGA植入物引导了具有完整长骨结构的新骨形成。

Nanocomposite of hydroxyapatite (HAP) surface-grafted with poly(L-lactide) (PLLA) (g-HAP) showsa wide application for bone fixation materials due to its improved interface compatibility, mechanicalproperty and biocompatibility in our previous study. In this paper, a 3-D porous scaffold of g-HAP/poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) was fabricated using the solvent casting/particulate leaching method toinvestigate its applications in bone replacement and tissue engineering. The composite of un-graftedHAP/PLGA and neat PLGA were used as controls. Their in vivo mineralization and osteogenesis wereinvestigated by intramuscular implantation and replacement for repairing radius defects of rabbits. Aftersurface modification, more uniform distribution of g-HAP particles but a lower calcium exposure on thesurface of g-HAP/PLGA was observed.Intramuscular implantation study showed that the scaffold ofg-HAP/PLGA was more stable than that of PLGA, and exhibited similar mineralization and biodegradability to HAP/PLGA at the 12–20 weeks post-surgery. The implantation study for repairing critical radiusdefects showed that the scaffold of g-HAP/PLGA exhibited rapid and strong mineralization and osteoconductivity, and the incorporation of BMP-2 could enhance the osteogenic process of the compositeimplant. The new bone formation with the intact structure of a long bone was guided by the implant ofg-HAP/PLGA.

1. 引言

骨组织工程的主要目标之一是开发可生物降解的材料作为骨移植替代物，尤其是用于填充大型缺损的材料[1-4]。除了成骨细胞和生长因子外，作为支架的合成生物材料在骨组织工程和骨生成中也发挥着关键作用。它们为细胞生长和细胞外基质（ECM）的形成提供了三维（3D）空间，并为新形成的骨组织提供了结构支撑。理想的骨生成合成支架应满足一定的标准以发挥这一功能，包括良好的生物相容性、足够的力学性能以及与重塑相称的受控速率下的适当生物降解性[5, 6]。

羟基磷灰石（HA）作为天然骨骼的主要矿物成分，且结构与骨骼相似，是骨再生领域具有前景的无机生物材料之一。羟基磷灰石陶瓷在骨组织中具有高度的生物相容性，并具有较高的成骨潜力（骨传导和骨整合），但其在体内的脆性和疲劳失效限制了其临床应用，仅限于非负重修复和替代[2, 7]。羟基磷灰石陶瓷的另一个突出问题是其生物降解性差。烧结羟基磷灰石材料在植入9个月后未显示出可检测的再吸收[8]。

另一方面，可生物降解的合成聚酯，如聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）及其共聚物聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），在众多临床应用中已有相对较长的使用历史[6]。PLGA是最具前景的基质之一，常被用作组织工程的构建材料。通过控制共聚物的分子量和共聚物中丙交酯与乙交酯的单元比例，可以在一定程度上调节PLGA的力学性能和生物降解速率。用于骨修复应用的PLGA共聚物已证明具有生物相容性、无毒性和非炎症性[9, 10]。然而，由于PLGA机械强度低、过于柔软且缺乏成骨生物活性，因此也无法用于承重应用。因此，将这两种生物材料的优点结合起来，将获得比单独使用其中任何一种材料都更理想的性能[11]。

一系列生物陶瓷/聚合物复合材料已开发出来，用于骨固定和骨修复应用，并展现出一些吸引人的特性[12-14]。特别是纳米羟基磷灰石（nano-HAP）因其具有一些特殊性能而备受关注，这些性能包括较大的比表面积、改善的生物降解性和生物活性。可生物降解的纳米羟基磷灰石/聚合物复合材料被视为天然骨骼的临时替代品，因为它们均由纳米级羟基磷灰石和有机化合物（聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）或胶原蛋白）组成。纳米羟基磷灰石的合成程度越高，在组成、尺寸和形态上与天然骨骼越相似，其骨传导性就越好[15, 16]。纳米羟基磷灰石的引入大大提高了纳米羟基磷灰石/聚合物复合支架的力学性能，并增强了蛋白质吸附能力[14]。研究发现，矿化组织中的蛋白质充当天然的晶体工程师，在促进或抑制羟基磷灰石等矿物质的生长方面发挥着关键作用[17]。支架表面羟基磷灰石纳米颗粒的暴露程度越高，矿化程度和骨形成能力就显著增强[18]。

然而，对于这些纳米复合材料而言，纳米羟基磷灰石（nano-HAP）填料与聚合物之间的界面相容性和结合力是决定纳米羟基磷灰石在基体中的分布以及复合材料力学性能的关键因素。两相之间缺乏粘附会导致界面早期失效，从而降低支架的力学性能和结构稳定性。

在我们之前的研究中，合成了表面接枝聚左旋乳酸（PLLA）的纳米羟基磷灰石（HAP）颗粒（g-HAP），并且g-HAP/PLLA（或g-HAP/PLGA）纳米复合材料因其界面相容性、机械性能的改善以及良好的生物相容性，在骨固定材料方面展现出广阔的应用潜力[19-21]。为了探究这些复合材料在骨替代材料和组织工程支架方面的可能应用，我们通过将10wt%的g-HAP纳米颗粒混合到PLGA基质中，获得了g-HAP/PLGA纳米复合材料。采用溶剂浇注/颗粒浸出法制备了g-HAP/PLGA多孔支架，并将其植入兔背部肌肉和桡骨缺损处，以进行体内矿化和成骨实验。

2 材料与方法

2.1 多孔支架制备　

1）材料组成，合成及表面修饰处理：PLGA，80：20，MW＝196,000。为减少纳米粒子团聚，提高纳米粒子的分散性，增强其与聚合物的界面结合力，HAP为水热法合成的羟基磷灰石纳米颗粒（长100nm，宽20－40nm），并采用原位聚合方法进行LLA自修饰，获得PLLA表面接枝率为5%的g-HAP，见下图1-2。

2）3D支架制备：通过将g-HAP或HAP纳米颗粒预先悬浮在一定体积的氯仿中，然后在磁力搅拌下将其混合到10%的PLGA/氯仿溶液中，并持续搅拌过夜，最后进行30分钟的超声处理，从而制备出g-HAP/PLGA和HAP/PLGA复合材料。在复合材料中，g-HAP或HAP的含量为10wt%。

　　将通过筛网获得的直径为100-450μm的蔗糖颗粒混合到g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA溶液中。将混合物浇铸成玻璃圆盘，并在空气中干燥3天。复合材料（或PLGA）/蔗糖的质量比为1:6（w/w）。随后，通过将复合材料在蒸馏水中浸渍5天（每12小时更换一次水）来从复合材料中去除蔗糖颗粒，然后在空气和真空下干燥复合材料。然后将获得的复合材料多孔支架切成小条（宽0.3cm，长2.0cm），用紫外线照射灭菌30分钟。

2.2 支架表征

根据已发表的方法[22]，通过液体置换法测量支架的孔隙率值。简而言之，将重量为W的样品浸入含有已知体积（V1）乙醇的量筒中，并进行一系列短暂的抽真空-再加压循环，以迫使乙醇进入样品的孔隙中。持续循环直至样品中不再观察到气泡冒出。然后记录乙醇和乙醇浸渍过的支架的总体积为V2。小心地从量筒中取出乙醇浸渍过的样品，并记录剩余乙醇的体积为V3。泡沫中保留的乙醇体积为（V1 − V3），该体积被确定为泡沫的空隙体积。泡沫的总体积为（V2 − V3）。因此，样品的开孔率（η）可通过以下公式获得：η = (V1 − V3)/(V2 − V3)。同时，将样品切割并在溅射镀膜机中镀上金/钯。在发射扫描电子显微镜（ESEM）（Philips XL30 ESEM FEG，日本）下研究g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA多孔支架的孔隙结构。使用NIH Image J测量每种材料的200个孔。为了表征g-HAP或HAP在PLGA基质中的分布和暴露程度，使用能量色散X射线光谱仪（EDX）（Philips，XL-30W/TMP，日本）进行分析。

2.3. 肌肉内植入

将g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA的无细胞多孔支架通过肌肉注射植入体内，以进行体内生物降解和矿化评估。通过手术将宽度为0.3厘米、长度为2.0厘米的植入物嵌入18只兔子的背部肌肉中。每只兔子每种材料使用三个平行样本。手术后，分别在4周、8周、12周和20周时通过空气注射处死兔子。取出植入物，用数码相机（富士FinePix S602，中国）进行宏观观察并记录。随后，将样本在室温下用4%多聚甲醛固定2小时。每个时间段的每种材料各取三个样本，用蒸馏水洗涤三次，然后冷冻干燥48小时，以进行扫描电子显微镜（SEM）、计算机断层摄影（CR）和钙含量分析。其他活检样本用于组织学分析。分析过程简要描述如下。

2.4. 植入术修复桡骨缺损

根据图1，使用锯子和钻头在每只兔子前肢的桡骨上制造出双侧临界大小的缺损，方法为去除中段骨干2.0cm。将PLGA、HAP/PLGA、g-HAP/PLGA和BMP-2/g-HAP/PLGA的多孔支架条（宽0.3cm，长2.0cm）分别置入不同兔子的缺损中。BMP-2/g-HAP/PLGA支架是通过将g-HAP/PLGA支架浸入4℃的PBS溶液（含100ng/ml BMP-2）中过夜制备的。伤口用丝线逐层缝合。手术后，将兔子放回笼中，让其自由活动。所有兔子每天肌肉注射青霉素，每只兔子注射200000单位，持续3天。所有伤口均逐渐愈合，兔子活动自如，无术后并发症。

2.5. X射线检查

在术后0周（术后第一天）、2周、4周和8周，使用计算机断层摄影（CR，Kodak CR-400plus，美国）检查了用PLGA、HAP/PLGA、g-HAP/PLGA和BMP-2/g-HAP/PLGA修复的兔桡骨缺损处的体内矿化和成骨情况。在麻醉状态下，根据图1所示，将兔子俯卧位暴露于X射线中。

同时，对术后4周、8周、12周和20周的g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA支架的体外肌肉内植入物进行了CR检查。

Fig 1.  Bilateral rabbit radius defects were created by removing 2.0cm of midshaft diaphyseal bone.

2.6. 用于钙含量测量的ICP-AES分析

使用电感耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）（Leeman Prodigy High Dispersion ICP，美国）测定了术后4周、8周、12周和20周的g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA肌内植入物以及术前支架的钙含量。取约10.0 mg样品并精确定量，然后用5.0 ml硝酸完全消化样品，蒸发并溶解于10.0 ml蒸馏水中。通过ICP-AES分析溶液中的钙浓度。最后，根据所得浓度计算植入物样品的钙含量。每种材料在所有时间间隔下均分析了三个平行样品。

2.7．组织学分析

术后8周对植入物进行了组织学分析。样本用4%多聚甲醛固定24小时，在10%乙二胺四乙酸（EDTA）中脱钙2-4周，包埋在石蜡中，并使用切片机（德国Leika RM2145切片机）切割，得到5μm厚的切片。切片用苏木精和伊红（H&E）染色，并进行马松三色染色，然后在光学显微镜下进行评估。

2.8. 统计分析

所有定量数据均使用Origin 7.0软件（美国OriginLab公司）进行分析，并以平均值±标准差的形式表示。采用方差分析（ANOVA，Origin 7.0）进行统计比较。p<0.05的值被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1. 支架表征

3.1.1 扫描电子显微镜（SEM）和孔隙率分析

采用溶液浇注/颗粒浸出法制备的g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA三维（3-D）多孔支架的微观结构通过扫描电子显微镜（SEM）进行了分析（图2和图3）。图2显示，我们制备的所有支架均具有不规则的大孔，且孔隙相互连通。g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA支架材料的平均孔径分别为148.2±76.1、146.9±65.4和137.3±53.2微米（表1）。g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA支架的开孔率分别为86.6±0.9%、85.9±4.6%和83.6±2.4%。然而，三种支架在孔径和开孔率方面没有显著差异（P>0.05）。

Fig.2. SEMmicro-photographs of porous scaffolds of g-HAP/PLGA(a&b), HAP/PLGA(c&d)and PLGA(e&f) fabricated with thesolvent casting/particulate leaching method.Bar lengths are 200mm(e),100mm(a&c), 50mm(d&f) and 20mm(b).

Table 1 Pore size (mm) of g-HAP/PLGA, HAP/PLGA, PLGA porous scaffolds fabricated with thesolvent casting/particulate leaching method

图3展示了支架中孔壁的表面形貌。由于在PLGA基质中填充了10wt%的纳米g-HAP或HAP，g-HAP/PLGA和HAP/PLGA复合材料中的孔壁显得较为粗糙。g-HAP/PLGA与HAP/PLGA之间的明显差异在于，g-HAP/PLGA的孔壁表面颗粒分布比HAP/PLGA更为均匀（图3a-b）。在HAP/PLGA支架中，普遍观察到未接枝的HAP聚集形成较大的颗粒（直径约2-5μm）（图3b）。与纳米复合支架相比，纯PLGA支架的孔隙更为平坦（图2-f），孔壁也更为光滑（图3c）。这表明g-HAP/PLGA和HAP/PLGA纳米复合支架具有更稳定的微观结构，且与未接枝的HAP相比，接枝了PLLA的HAP（g-HAP）的表面改性能够使纳米颗粒在复合支架表面的分布更为均匀。

Fig.3. SEM analysisshowed the topographyof the pore wall surface of g-HAP/PLGA(a),HAP/PLGA(b)and PLGA(c) porous scaffold.The different appearances of rough pore wall in compositescaffolds of g-HAP/PLGA(a) andHAP/PLGA scaffold( b),and smooth pore wall in pure PLGAscaffold(c) are shown clearly.Moreover, g-HAP/PLGA exhibits more uniform granules on the pore wall surfacethan HAP/PLGA. All bar lengths are 10mm(a, b&c).

3.1.2. 能量色散X射线光谱（EDX）分析

采用EDX元素分析评估多孔支架表面钙（Ca）和磷（P）元素的含量。结果表明，g-HAP/PLGA支架表面的钙和磷暴露水平低于HAP/PLGA支架（图4）。相比之下，PLGA支架表面无钙和磷暴露。这表明，由于表面接枝的HAP颗粒被一层聚左旋乳酸（PLLA）覆盖并嵌入PLGA基质中，改善了HAP与PLGA之间的界面，因此接枝聚左旋乳酸的HAP颗粒的表面改性会在一定程度上减少g-HAP/PLGA复合材料表面的钙暴露。

Fig.4. EDX analysisshowed the contents of calcium and phosphorus on the surfaces of g-HAP/PLGA (a), HAP/PLGA(b) and PLGA(c) porousscaffolds.

3.2. 肌肉内植入

3.2.1 宏观观察

术后4、8、12和20周，分别取出植入兔背肌的g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA多孔支架，并进行宏观观察分析（图5）。术后最初8周，所有g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA肌内植入物均保持其原始形状。植入物外观呈肉色，与邻近肌肉组织紧密结合。植入物周围无明显结缔组织包裹（图5-a和b）。术后12周，g-HAP/PLGA和HAP/PLGA复合植入物明显变小，而纯PLGA植入物因降解而变得细长并断裂成数块（图5-c）。术后20周，纯PLGA植入物区域几乎无支架残留。然而，在g-HAP/PLGA和HAP/PLGA两组中，三个植入物中的一个部分或完全矿化，而其他两个则因生物降解而大部分消失。矿化后的植入物变得坚硬，难以与邻近组织分离（图5-d）。

Fig.5.Macroscopic observation of the representative implants of g-HAP/PLGA(left),HAP/PLGA(middle) and PLGA(right) scaffoldsembedded in rabbit dorsal muscles at 4(a),8(b),12(c) and 20(d) weekspost-surgery. The photos were taken by Fujifilm FinePixS602 Digital Camera with 6× Optical Zoom.

3.2.2 X射线检查

术后4、8、12和20周，通过计算机断层扫描（CR）检查了g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA的肌内植入物。图6显示了不同时间间隔下每种材料的三个平行植入物的放射学影像。术后4、8和12周，g-HAP/PLGA和HAP/PLGA的植入物清晰可见，并基本保持其原始形状。这些植入物未显示出明显的矿化现象。术后20周，g-HAP/PLGA或HAP/PLGA的三个植入物中，仅有一个表现出明显的矿化，而其他植入物因降解而失去其原始形状并变得模糊。然而，在PLGA组中，植入物的形状在术后8周略有变化，在术后12周变化明显。术后8周的一个植入物放射学影像以及术后12周和20周的所有三个植入物的放射学影像均变得非常模糊。这表明，g-HAP或HAP填料可以提高PLGA多孔支架的稳定性，并延长其生物降解时间。同时，作为PLGA基质中填料的PLLA接枝HAP纳米复合材料，其增强体内矿化和吸收的能力与未接枝的HAP相似。

Fig.6.Computer radiographs showed the mineralization and osteogenesis of the intramuscular implants of g-HAP/PLGA(a), HAP/PLGA(b) and PLGA(c) at 4, 8,12 and 20 weeks post-surgery. At 20 weeks post-surgery, osteogenesis wasobserved distinctly in one of the three implants in both g-HAP/PLGA andHAP/PLGA groups, pointed by the arrow.

3.2.3. 扫描电子显微镜（SEM）分析

图7展示了术后8周时g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA肌内植入物的扫描电镜（SEM）照片。三种材料中，植入物与肌肉组织之间的界面均清晰可见（图7-a、c和e）。g-HAP/PLGA和HAP/PLGA复合支架的微观结构比PLGA更为疏松，但g-HAP/PLGA中的孔隙比HAP/PLGA更多，以保持其原始形状。与复合支架相比，PLGA中的孔隙因生物降解而消失，并被新形成的组织所替代。结果表明，用聚乳酸（PLLA）对羟基磷灰石（HAP）进行表面改性可以提高复合支架在体内的微观结构稳定性。

此外，术后8周时，g-HAP/PLGA和HAP/PLGA复合支架中的矿化沉积物更多，矿化区域更大，与纯PLGA支架相比（图7和图8）。图8通过扫描电子显微镜（SEM）和能量色散谱（EDX）分析，展示了术后8周时g-HAP/PLGA和HAP/PLGA植入物中的典型矿化和成骨区域。这些区域呈现骨蜂窝状结构，含有少量大孔（>5μm）和大量微孔（<1μm）（图8-a和b）。EDX元素分析显示，这些区域（图8-c1）中的钙（Ca）和磷（P）含量显著高于g-HAP/PLGA植入物中的其他区域（图8-c2）和g-HAP/PLGA术前支架（图4a）。g-HAP/PLGA复合支架（图7-b）和HAP/PLGA复合支架（图7-d）中发现了典型结构，而PLGA植入物中则未发现（图7-f）。综上所述，g-HAP/PLGA和HAP/PLGA复合支架表现出相似的矿化能力，且均优于纯PLGA支架。

Fig.7. SEM micrographsof the porous scaffolds of g-HAP/PLGA (a&b),HAP/PLGA(c&d), and PLGA(e&f) embedded in rabbit back musclefor 8 weeks. S was the area ofscaffold implant, M was the area ofmuscle tissue, and I was theinterface between the implant and the muscle tissue. The red circles in (b) and (d) represented the typical mineralized areas in the implants ofg-HAP/PLGA and HAP/PLGA respectively. Bar lengths are 500mm(a, c &e) and 100mm(b, d&f).

Fig.8. SEM and EDXanalysis of the intramuscular implants of g-HAP/PLGAand HAP/PLGA at 8 weeks post-surgery.(a)&(b) were amplificatory SEM micrographs of the circled areas inFig.7(b&d), which showed thetypical mineralized and osteogenic areas with a few of macro-pores(>5mm) and an abundance ofmicro-pores(<1mm) inthe implants of g-HAP/PLGA (a) and HAP/PLGA(b)respectively. (c) showed high levelsof Ca and P in these mineralized areas (c-1)compared to the other areas(c-2) inthe implant of g-HAP/PLGA with EDX analysis. Bar lengths of (a) and (b) are5mm.

3.2.4. 用于测量钙含量的ICP-AES分析

术后4至20周，采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）测定g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA支架肌内植入物的钙含量（图9）。结果显示，术前g-HAP/PLGA和HAP/PLGA植入物的钙含量分别为2.94±0.72 wt%和3.32±0.45 wt%。尽管本研究中使用的纳米复合材料是PLGA基质中10 wt%的g-HAP或HAP纳米颗粒，但g-HAP/PLGA和HAP/PLGA之间钙含量的差异是由于g-HAP颗粒中接枝了5.0-6.0 wt%的PLLA。术后4至12周，g-HAP/PLGA和HAP/PLGA两组的钙含量几乎保持在术前水平。仅在HAP/PLGA组中，术后8周的钙含量较术前略有增加，钙含量水平为4.16±0.02%。

术后20周时，g-HAP/PLGA组和HAP/PLGA组三个植入物中的一个的钙含量分别急剧上升至18.7wt%和19wt%，几乎是术前含量的6倍。g-HAP/PLGA组的其他植入物的钙含量分别为2.09wt%和2.26wt%，HAP/PLGA组的其他植入物的钙含量分别为5.82wt%和4.53wt%。相比之下，PLGA组的钙含量在所有时间间隔内均保持在较低水平，为0-0.29wt%。这表明含有g-HAP或HAP纳米粒子的复合支架有两种可能的结果，即完全降解或定向成骨，这取决于植入物周围的微环境，如成骨细胞、生长因子、酶和pH值等。所得的ICP结果与X射线检查的放射学图像高度一致。

Fig.9. ICP-AESanalysis showed calcium contents of the intramuscularimplants of g-HAP/PLGA, HAP/PLGA and PLGA porous scaffolds embedded in rabbitdorsal muscles at 0(pre-surgery), 4, 8, 12 and 20 weeks post-surgery. Large standard deviations in g-HAP/PLGAand HAP/PLGA at 20 weeks post-surgery resulted from only one of three implantsfor each composite mineralized highly.

3.2.5.组织学分析

术后8周，对g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA的肌内植入物进行了组织学分析，采用了苏木精-伊红（H&E）染色和马松三色染色（图10和图11）。图10展示了三种植入物的H&E染色结果。左侧图片展示了植入物与肌肉组织之间的界面（a-1、b-1和c-1），右侧图片展示了植入物的中心区域（a-2、b-2和c-2）。

术后8周，在所有g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA植入物中均可清晰观察到支架的孔隙结构。在g-HAP/PLGA中，边缘区域和中心区域均存在大量多核巨细胞。这些细胞具有密集的圆形核和核仁，在孔隙周围聚集形成岛屿状或条带状，环绕孔隙壁（图10a-b和图11b-c）。在HAP/PLGA中也发现了类似的多核巨细胞，但大多数细胞已坏死。一些细胞核不规则且模糊，另一些则消失，仅留下空洞。在PLGA植入物中未观察到多核巨细胞。同时，马松三色染色显示，g-HAP/PLGA中形成的胶原纤维（深绿色）比其他两种材料更多（图11）。

Fig.10. Histologicalanalysis showed the representative micrographs of g-HAP/PLGA(a-1&2),HAP/PLGA(b-1&2) and PLGA(c-1&2) implanted intramuscularlyfor 2 months. Left pictures (a-1, b-1, c-1) show the adjacent area of theimplants to the muscles, and right pictures (a-2, b-2 and c-2) show the centerarea of the implants. H&E staining.  Allscale bars are 25mm.

Fig.11. Masson’s trichromestaining showed themicrographs of the g-HAP/PLGA(a&b),HAP/PLGA(c&d) and PLGA(e&f) implants embedded in rabbit dorsal muscles. Red color shows muscletissue, dark green color shows collagen fiber, and red yellow shows bloodcells. Scale bars are 25mm(a,c&e) and 250mm(b, d &f)respectively.

3.3 桡骨缺损的植入物

骨修复实验采用临界大小的2.0厘米半径缺损，用无细胞材料棒进行替换。仅有一只动物因麻醉过量而死亡，其他动物均顺利度过手术。术后未出现任何重大事件或不良反应。在不同时间间隔对动物进行CR（计算机断层扫描）检查，并在术后8周处死动物进行组织学分析。

3.3.1 X射线检查

图12展示了术后0、2、4、8周时，使用BMP-2/g-HAP/PLGA、g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA植入物修复的兔桡骨缺损（长2.0 cm）的典型放射学结果。在开始时（术后第一天），所有组的骨缺损区域均未观察到明显影像。

术后2周，所有组别中缺损区域的骨形成均导致相邻骨骼两端之间出现不同程度的桥接。BMP-2/g-HAP/PLGA、g-HAP/PLGA和HAP/PLGA组的修复区域X光片显示相似，且植入物表现出明显的矿化（图12a-2、b-2和c-2）。除g-HAP/PLGA组因意外尺骨骨折导致植入物异常移动外，BMP-2/g-HAP/PLGA组和HAP/PLGA组的植入物均与相邻骨骼的末端紧密结合。与其他组相比，BMP-2/g-HAP/PLGA组的新骨形成量更多。相比之下，PLGA组仅在植入物靠近相邻骨组织的表面和末端区域表现出轻微的矿化（图12d-2）。

术后4周和8周时，所有组别修复区域的密度逐渐增加（图12）。BMP-2/g-HAP/PLGA组和HAP/PLGA组的骨桥更加完美且光滑（图12a-3,4&c-3,4）。在g-HAP/PLGA组中，术后4周时，植入物与邻近骨之间的间隙明显缩短（图12b-3），术后8周时消失（图12b-4）。尽管PLGA组在术后8周时，骨膜引导了植入物表面的骨形成，并形成了细长的桥接（图12d-3,4），但仍有近一半的原始骨缺损面积未修复。

结果表明，与纯聚合物支架相比，PLGA与g-HAP或HAP的复合物能更快地矿化、与邻近骨骼结合并促进骨生成。BMP-2的加入可改善g-HAP/PLGA的矿化和骨生成，并加速骨愈合过程。不含HAP成分的聚合物支架主要从附近桡骨的骨膜诱导骨形成。

Fig.12. Representative computer radiographs (CR) of rabbit radius defectsimplanted with the porous scaffolds of BMP-2/g-HAP/PLGA (a-1～4),g-HAP/PLGA(b-1～4) , HAP/PLGA(c-1～4) , and PLGA(d-1～4)at 0, 2, 4 and 8 weeks post-surgery. There were more mineral deposit and newbone formation in the groups of BMP-2/g-HAP/PLGA, g-HAP/PLGA, HAP/PLGA thanthat in the group of PLGA .(a-1, b-1, c-1&d-1) 0 weeks(the firstday after surgery); (a-2, b-2,c-2 &d-2) at 2 weeks; (a-3, b-3, c-3,& d-3) at 4 weeks; (a-4, b-4,c-4& d-5) at 8 weeks.

3.3.2 组织学分析

图13展示了术后8周植入BMP-2/g-HAP/PLGA、g-HAP/PLGA、HAP/PLGA和PLGA支架的桡骨缺损部位的横截面显微照片。植入BMP-2/g-HAP/PLGA、g-HAP/PLGA或HAP的缺损部位具有相似的组织学外观（图13a、b、c）。在这些组中，新形成的骨骼具有完整的长骨结构，包括具有连续厚皮质的管状骨干和位于骨干中心充满骨髓的骨髓腔。BMP-2/g-HAP/PLGA组中的骨干大于g-HAP/PLGA组和HAP/PLGA组。未吸收的支架位于尺骨附近的一个三角形区域以及这些组中的桡骨新骨中。相比之下，在PLGA植入组中，仅观察到支架表面覆盖一层不规则的薄皮质，且新骨中未形成骨髓腔（图13d）。

Fig.13.Radius defects healing. In this figure, representativephotomicrographs of cross sections throughthe radius bone defect sites implanted with BMP-2/g-HAP/PLGA(a), g-HAP/PLGA (b), HAP/PLGA(c) and PLGA(d) scaffolds at 8 weeks post-surgery arepresented . The sections were treated with Masson’s staining. (a&c) were taken by a digital camera and (b&d) were taken by alight microscope. Scale bars are 1000mm(a&c) and 250mm (b&d).

新骨与支架之间的界面如图14所示。在BMP-2/g-HAP/PLGA和g-HAP/PLGA组中，界面规则，且界面内形成了一层明显的纤维结缔组织（图14a和b）。然而，在HAP/PLGA和PLGA组中，界面不规则，且无明显纤维结缔组织（图14c和d）。在所有组中，残留支架区域均存在大量多核巨细胞。这些细胞出现在支架的孔隙中，并靠近孔壁表面。这表明多核巨细胞在支架降解和骨生成中起着重要作用，类似于破骨细胞或成骨细胞。

Fig.14. Representative photomicrographs of verticalsections through the radius bonedefect sites implanted with BMP-2/g-HAP/PLGA(a), g-HAP/PLGA(b),HAP/PLGA(c) and PLGA(d) scaffolds at 8 weeks post-surgery.The large arrows show the interfaces between the scaffolds and newly formedbones, and the slender arrows represent the axis orientations of the newlyformed bones. Masson’s trichromestaining.  Scale bars are 25mm(a&b) and 100mm(c&d).

4 讨论

组织工程为受损组织或器官衰竭的治疗提供了一种新方法。骨组织工程的发展与材料技术的变革直接相关，尤其是与可用于大型骨科缺损重建且在力学性能上更适应其生物环境的生物材料的发展[2]。根据我们之前的研究，g-HAP/PLLA和g-HAP/PLGA纳米复合材料展现出一系列有前景的特性，包括更好的生物相容性、增强的力学性能和改善的热稳定性[19-21]。人软骨细胞和兔成骨细胞能在纳米复合材料表面良好地附着、铺展和生长。为了将其用作骨科替代材料，本文制备了g-HAP/PLGA的三维结构支架，该支架为含有10%（w/w）表面接枝有PLLA（g-HAP）的羟基磷灰石纳米颗粒的PLGA基质。通过肌肉内植入和修复关键骨缺损的植入物，研究了g-HAP/PLGA的体内矿化和成骨作用。

用于成骨的合成支架应模仿骨骼的形态、结构和功能，以优化其与周围组织的整合。众所周知，骨骼是由沉积在有机基质（95%为I型胶原）中的羟基磷灰石（Ca10(PO4)6(OH)2）晶体组成的结构[23]。纳米级合成的羟基磷灰石与骨磷灰石更为相似，且能促进培养成骨细胞的附着并提高其代谢活性[1,24,25]。已证实，在体外成骨细胞培养基质中添加人造羟基磷灰石可促进矿化[26]。这些颗粒为成骨细胞提供了锚定点，并为细胞附着提供了更有利的表面，决定了材料支持骨向内生长或作为生物模板的能力[27]。我们制备的g-HAP/PLGA作为磷灰石-有机聚合物复合材料之一，模仿了天然骨骼的成分，即10wt%改性羟基磷灰石（HA）纳米粒子均匀分布在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）基质中。支架中的聚合物PLGA作为骨中的胶原基质，为成骨提供结构支持。结果表明，无论作为肌肉内植入物还是骨缺损替代物，g-HAP/PLGA多孔支架作为细胞生长和迁移的基质，均表现出更好的生物相容性。

表面形貌对细胞附着至关重要[27]。孔壁粗糙度以及大孔隙率（孔径>50μm）在成骨结果中发挥着重要作用[5]。据认为，表面粗糙度可促进锚定依赖性成骨细胞的附着、增殖和分化[28]。表面能可能在将特定蛋白质吸引到材料表面方面发挥作用，进而影响细胞与材料的亲和力[2]。已有报道显示，羟基磷灰石（HAP）/聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）复合支架具有良好的成骨效果[18]。为改善羟基磷灰石（HAP）纳米粒子的分布和纳米复合材料的力学性能，本文根据我们之前的工作，通过聚乳酸（PLLA）表面接枝获得了用于本文的g-HAP[19]。与PLGA相比，由于颗粒附着或嵌入孔壁表面，g-HAP/PLGA或多孔支架的孔壁更为粗糙。此外，与HAP/PLGA中未接枝的HAP相比，g-HAP/PLGA中接枝的HAP在孔壁上的分布更为均匀。

起初，我们担心用聚乳酸（PLLA）对羟基磷灰石（HAP）颗粒进行表面改性会降低其矿化和成骨能力。但结果显示，尽管g-HAP/PLGA中HAP的实际含量低于HAP/PLGA，但其复合材料的矿化和成骨能力与HAP/PLGA相似。在g-HAP/PLGA组中观察到一个有趣的现象：一只兔子的植入体在术后2周因意外尺骨骨折而发生断裂并异常移动[图12. b-2]。2周后，g-HAP/PLGA植入体的骨折开始达到骨结合[图12. b-3]，并在术后8周完全消失[图12. b-4]。同时，由于植入体移动，植入体与邻近骨端之间的间隙越来越小[图12. b2-4]，并通过g-HAP复合支架的成骨作用达到结合。在BMP/g-HAP/PLGA组中也观察到了与HAP/PLGA相似的快速骨修复过程。在用纯PLGA修复的缺损中，初始矿化始于植入体靠近邻近骨组织的两端，然后从两端逐渐向植入体中心延伸，直到术后8周，植入体中心仍留有一大片未矿化区域。

在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）基质中，聚乳酸（PLLA）接枝和未接枝纳米羟基磷灰石（nano-HAP）的多孔纳米复合支架的体内矿化和生物降解过程十分复杂。术后不同时间间隔，矿化沉积、生物降解和组织再生之间的平衡会发生显著变化。在本研究中，根据我们之前的研究[20,21]，使用了PLGA基质中含10% g-HAP或HAP颗粒的支架。肌肉内植入研究表明，g-HAP/PLGA和HAP/PLGA复合支架在术后5个月或6个月时，在背部肌肉中会产生两种可能的结果：完全降解或成骨。还有一个有趣的问题是，为何g-HAP和HAP复合支架的植入物中，只有一两个而非全部转化为成骨，而其他则完全降解。一些未知因素似乎会影响上述平衡，如周围环境中成骨细胞、微血管和破骨细胞（或多核巨细胞）的数量。尤其是多核巨细胞可能在合成植入物的最终结果中发挥重要作用。

此外，复合材料中羟基磷灰石（HAP）的含量也是矿化和成骨的重要因素。据认为，增加羟基磷灰石（HA）的体积可增强细胞反应[27]。作为本文的初步研究，在g-HAP/聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）复合材料中仅使用了10%（w/w）的g-HAP。由于g-HAP是羟基磷灰石与聚乳酸（PLLA）接枝的产物，因此g-HAP/PLGA中HAP的实际含量低于HAP/PLGA。与HAP/PLGA组相比，本研究中观察到的g-HAP/PLGA组的矿化和成骨增强效果并不明显。我们得出结论，主要原因是g-HAP/PLGA中HAP的含量（或钙和磷的水平）低于HAP/PLGA。因此，在我们后续的研究中，应将材料中钙和磷的初始水平设计为可比水平，以评估羟基磷灰石和聚合物作为骨替代材料的复合物。

5. 结论

采用溶剂浇注/颗粒浸出法制备了聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和聚乳酸（PLLA）接枝纳米羟基磷灰石（g-HAP）复合物的三维多孔支架。与未接枝的羟基磷灰石（HAP）相比，接枝HAP的纳米颗粒在PLGA基质表面的分布更加均匀。肌肉内植入研究表明，g-HAP/PLGA纳米复合物有两种结果：矿化或完全生物降解，这可能取决于聚合物基质中HAP的含量以及生物降解、矿化和组织再生的平衡。作为骨替代材料，g-HAP/PLGA支架在修复关键桡骨缺损方面表现出快速且强大的骨传导性。BMP-2的掺入可增强复合植入物的成骨过程。结论是，尽管g-HAP/PLGA中钙（Ca）和磷（P）的暴露水平以及HAP的实际含量低于HAP/PLGA，但g-HAP/PLGA复合支架在肌肉内植入和骨缺损替代方面表现出相似的强大矿化、成骨和生物降解能力。

致谢

本项目得到中国国家自然科学基金（编号：50673090）、国家杰出青年科学基金（编号：50425309）和中国科学技术部“863”计划（编号：2007AA03Z320）以及中国科学技术部国际合作重点项目（编号：20071314）的资助，特此致谢。

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被引文献：