图1 ChtBD bFGF（ChiBD bFGF）绑定几丁质膜用于伤口愈合的示意图。ChtBD-bFGF能够主动识别并结合几丁质的伤口敷料，发挥长效缓释作用，促进植入部位的细胞化和血管化《1［1］。

       bFGF是一种有丝分裂原，是成纤维细胞和血管内皮细胞的调节因子。在创伤部位，血小板释放的bFGF可促进内皮细胞增殖和血管生成。这种效应对组织生长和组织重塑很重要（Barrientos、Stojadinovic、Golinko、Brem和Tomic Canic，2008）。bFGF的直接应用并不能加速伤口愈合，因为在伤口部位bFGF会迅速冲洗丢失或被伤口敷料吸收（Richard等人，1995年）。不适当的伤口敷料会在4小时内使bFGF浓度降低50%（Finetti&Farina，1992）。

甲壳素/壳聚糖是一种天然衍生聚合物，具有生物可降解、生物相容性、无毒、抗菌、水合等优点。近几十年来，这些特性使得壳聚糖能够被加工成许多伤口敷料（Abdel Mohsen等人，2016；Archana，Dutta和Dutta，2016）。几丁质膜已用于修复大鼠伤口模型，显示出加速伤口愈合的能力（Yusof、Wee、Lim和Khor，2003）。利用壳聚糖创面敷料能稳定控制生长因子的释放。Nimura等将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）加入壳聚糖溶液中，通过冷冻干燥制备不同浓度的bFGF-壳聚糖膜。伤口愈合结果表明，碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖膜是一种稳定的促进伤口愈合的载体（Mizuno等人，2003年）。然而，生长因子在体内是不稳定和扩散性的，容易丢失或失活。

为实现生长因子在体内更加安全长效的作用，以及更便捷稳定地与材料相结合，中科院长春应化所团队利用现代合成生物学技术，设计了一种与几丁质/壳聚糖具有高亲和力的新型bFGF（ChtBD-bFGF）。该新型因子是在bFGF中引入了几丁质结合域（ChtBD），而该结构域来源于循环芽孢杆菌WL-12几丁质酶A1（ChiA1），54个氨基酸（见图2和图3）。

Fig. 3. SDS-PAGEand western blotting of ChtBD-bFGF and bFGF fusion protein. (A) SDS-PAGEanalysis of purified fusion proteins. M, protein marker; lanes 1–2, purified ChtBD-bFGF,and bFGF proteins, respectively. (B) Western blotting of purified ChtBD-bFGFand bFGF. Purified ChtBD-bFGF and bFGF proteins were analyzed by westernblotting with mouse anti-bFGF and HRP-labeled rabbit anti mouse IgG antibody.

ChtBD-bFGF与几丁质的结合机制。为了揭示ChtBD-bFGF与几丁质结合的机制，我们通过HoDock1对接方法预测ChtBD、bFGF和N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）之间相互作用形成的复合物，该方法包括初始刚性对接和精细半柔性对接。由北京工业大学生命科学与生物工程学院王存新研究组开发的对接程序 HoDock 包括从结合位点预测, 初步对接, 到对接后的精修聚类,打分筛选的各个步骤［2］。这里的蛋白质-蛋白质对接即是从自由状态的两个蛋白质的结构出发, 预测这两个蛋白质结合后的复合物结构模型。我们生成了9600个复杂结构，并对其进行评分，以确定最终正确的复杂结构模型（Gong等人，2010年；Pronk等人，2013年）。甲壳素是一种高分子碳水化合物分子，由长链的NAG单元通过糖苷键连接在一起。因此，ChtBD、bFGF和NAG之间的相互作用可以揭示ChtBD-bFGF与几丁质结合的机制。

图2显示复合物是由ChtBD、bFGF和NAG链之间的相互作用形成的。显示了4Å内原子周围的NAG。ChtBD-bFGF的NAG结合位点由6个氨基酸残基组成。含有NAG结合位点的5个氨基酸残基属于ChtBD。只有一个氨基酸残基来自bFGF。ChtBD与NAG的结合对bFGF的结构几乎没有干扰。预测结果表明，ChtBD-bFGF的几丁质结合位点主要位于ChtBD，而ChtBD-bFGF与几丁质的结合并不影响bFGF的生物活性。

ChtBD-bFGF与几丁质膜结合力和生物活性。我们通过ChtBD-bFGF与几丁质膜结合试验，验证了其结合力和生物活性。以单克隆抗bFGF抗体和二级Alexa-Fluor 488标记的抗鼠IgG抗体，采用免疫荧光法检测ChtBD-bFGF与几丁质膜的结合能力。将甲壳素膜分别浸泡在ChtBD-bFGF和bFGF浓度为500μg/ml的溶液中，4°C浸泡12h，以PBS浸泡相同条件的甲壳素膜为对照。用PBS 3×5min洗涤甲壳素膜，用兔抗鼠碱性成纤维细胞生长因子抗体（1∶2000稀释液）在室温下孵育2h。用PBS洗涤3×5 min后，将壳聚糖膜与二级Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG抗体（1:2000稀释液）在室温黑暗中孵育2 h，用荧光成像仪（CRI Maestro）采集ChtBD-bFGF和bFGF结合活性的光学数据。图4（B）显示ChtBD-bFGF@chitin胶片高于bFGF@chitin膜和甲壳素膜。结果表明，壳聚糖膜表面ChtBD-bFGF的含量高于bFGF。ChtBD-bFGF的平均信号强度是bFGF的3.02倍。

同时，通过体外细胞培养检测验证加入ChtBD结构域后对bFGF活性的影响。BALB/C 3T3细胞来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞培养中心。BALB/C 3T3细胞在含10%胎牛血清（FBS；Gibco）、100单位/ml青霉素（Sigma）和100 mg/ml链霉素（Sigma）的基础培养基中培养和扩增。细胞以1.2×10⁴/孔接种于96孔板（Costar）中。培养24 h后，除ChtBD bFGF和bFGF外，用含2%FBS的DMEM替换培养基。将培养物加入1 mg/ml甲基噻唑四唑盐（MTT）中，在37℃下培养4 h，去除培养基后加入400μl二甲基亚砜。立即测定492 nm处的吸光度。图4（A）所示为钟形曲线，在10–35 pM时活性最大。ChtBD bFGF和bFGF在适当浓度下促进成纤维细胞增殖，在高浓度（>100 pM）下抑制成纤维细胞增殖。ChtBD-bFGF活性曲线与bFGF活性曲线相似。结论ChBD不影响ChtBD-bFGF的活性。

Fig. 4.(A) Biological activity of bFGF and ChtBD-bFGF tested by stimulated BALB/C 3T3cell proliferation. (B) Chitin-binding ability

of bFGF and ChtBD-bFGF weredetected by immunofluorescence. (a, ChtBD-bFGF@chitin; b, bFGF@chitin; c,chitin film).   Error bars represent standard deviation for n = 3.

几丁质对ChtBD-bFGF和bFGF的摄取和释放。将甲壳素膜浸入500μg/mlChtBD-bFGF和bFGF溶液中获得ChtBD-bFGF@chitin薄膜，以及bFGF@chitin薄膜用于体外释放研究。将含有ChtBD-bFGF和bFGF的几丁质膜（1 mm²）在37℃和60 rpm搅拌下在2.0 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中培养。在指定的时间间隔内，收集0.2 ml上清液。OD280测定蛋白质含量。通过绘制释放蛋白累积含量百分比随时间的变化曲线，得到释放曲线。实验分三次进行。ChtBD-bFGF的吸附能力和bFGF与几丁质膜的结合如图5A所示。由于ChtBD-bFGF含有ChtBD，因此吸收的ChtBD-FGF比bFGF多（11.4倍）。图5B显示了ChtBD-bFGF和bFGF从几丁质薄膜中的体外累积释放行为。这些特征是释放百分比随时间的变化。不含ChtBD适配器的bFGF具有高爆发释放（图5B）；在最初的48小时内释放了约73%的负载bFGF。ChtBD-bFGF表现出持续释放行为ChtBD-bFGF@chitin薄膜。具体来说ChtBD-bFGF@chitin这种薄膜在48小时内首次爆发性释放7.6%，但随后在7天内释放速度较慢。释放动力学表明，90%的ChtBD-bFGF在释放7天后与几丁质膜紧密结合，这有助于生长因子以非扩散的方式与受体相互作用。在bFGF释放动力学中，7天后82%的bFGF释放到孵育缓冲液中，这表明bFGF以扩散的方式与受体相互作用。

Fig.5. The adsorption ability of ChtBD-bFGF and bFGF binding to the chitin film(A). Release kinetics of ChtBD-bFGF and bFGF from the chitin film (B). Errorbars represent standard deviation for n = 3.

皮下植入期间增强新生血管。将ChtBD-bFGF@chitin的甲壳质薄膜植入皮下，评估血管化能力。新生血管化是重塑和组织再生中至关重要的阶段（Wu，Chen，Scott，&Tredget，2007）。内皮细胞特异性蛋白标记物CD31用于评估皮下植入部位的新生血管化。植入后第7天，免疫荧光染色显示植入部位明显新生血管ChtBD-bFGF@chitin电影，bFGF@chitin薄膜和甲壳质薄膜（图7）；在以下部位没有明显的新生血管thebFGF@chitin薄膜或甲壳质薄膜。这表明ChtBD-bFGF@chitin膜的新生血管化能力高于bFGF@chitin电影。新生血管在伤口愈合过程中起着重要作用。理想的伤口敷料应促进血管生成。ChtBD-bFGF与几丁质膜的结合持续刺激细胞表面的受体。因此，有更多的新血管ChtBD-bFGF@chitin电影比其他群体。这ChtBD-bFGF@chitin薄膜是一种具有很强新生血管能力的伤口敷料。

Fig. 7. Histological analysis of vascularization induced byChtBD-bFGF@chitin films (A, D), bFGF@chitin films (B, E),   and chitin films (C,F). Panels A, B, C are the HE stain.The white arrowsindicate blood vessels. Panels D, E, F are CD31 immunofluorescence satin, andwhite arrows indicate endothelial (CD31) cell marker. Bar 200 μm.

bFGF对于伤口愈合至关重要，并且在肉芽组织形成、再上皮化和组织重塑中发挥作用（Power、McLeskey和Wellstein，2000）。而bFGF在慢性创面中的表达水平降低。临床上使用bFGF治疗伤口具有很大的治疗潜力（Robson，1997）。bFGF在创面常有突发性释放和低蓄积，需要长时间、大剂量给药才能维持治疗效果。高浓度的bFGF将导致肿瘤血管生成和血管肿瘤（Giavazzi等人，2003年；Liekens等人，2001年）。因此，结合bFGF的设计和合成被用来克服这些缺点。我们选择甲壳素膜是因为它们有利于促进皮肤快速再生和加速伤口愈合。几丁质已作为伤口愈合产品的一种成分制备成各种形式（Allen&Prudden，1966；Hoffmeister，Wenner，Wilkens和Mukhtar，1964；Prudden，Migel，Hanson，Friedrich和Balassa，1970；Yusof等人，2003）。

在这里，我们选择几丁质作为模型，制备新型多糖结合性生长因子。重组蛋白ChtBD-bFGF在促进成纤维细胞增殖方面具有与bFGF相同的生物学活性。ChtBD-bFGF体外几丁质结合能力是bFGF的11.4倍（最高286μg/cm2）。动物试验结果表明，ChtBD-bFGF比bFGF更有效地通过几丁质（壳聚糖）膜敷料的担载和植入，促进移植部位的血管生成，加速创面愈合。

该文章发表于CarbohydratePolymers（2017），该项技术获得中国发明专利授权（201510887465.8），并在团队的产业化公司实现落地转化。未来我们将围绕这种生长因子独特的几丁质/壳聚糖结合特性，开发基于几丁质多糖材料的系列体外和体内再生医学产品，包括细胞培养关键载体材料和急性慢性创面的创伤修复材料。

参考文献：

1.   A chitin film containing basicfibroblastgrowth factor with a chitin-binding domain as wound dressings. CarbohydratePolymers,2017, 174:723-730。Yu Wang, Chuan Fu, ZhenxuWu,Li Chen,Xuesi Chen,Yen Wei,Peibiao Zhang*.

2.   X. Q. Gong, P. W. Wang, F.Yang, S. Chang, B. Liu, H. Q. He, L. B. Cao, X. J. Xu, C. H. Li*, W. Z. Chen,C. X. Wang*. Protein-protein docking with binding site patch prediction andnetwork-based terms enhanced combinatorial scoring. Proteins2010;78(15):3150-3155.

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