［重点文章推送］RGD共聚物用于g-HAP/PLGA纳米复合骨组织工程支架支架（Biomacromolecules，2011）

中英文摘要

［摘要］为改善细胞黏附，已开发出多种在生物材料上对RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）肽进行表面修饰的方法。本研究旨在考察RGD偶联共聚物RGD/MPEG-PLA-PBLG（RGD共聚物）通过与聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和表面接枝聚左旋乳酸（g-HAP）的羟基磷灰石纳米颗粒复合物混合后，促进骨再生的能力。采用溶剂浇注/颗粒浸出法制备多孔支架，并在接种兔自体骨髓间充质细胞（MSCs）后将其移植以修复兔桡骨缺损。加入RGD共聚物后，支架的孔隙率和孔径未受显著影响。RGD肽的氮元素以及g-HAP的钙和磷元素可同时暴露在支架表面。尽管其浸出液的细胞活力为92%，低于g-HAP/PLGA，但其对3T3细胞和成骨细胞的黏附和生长有显著促进作用。当RGD共聚物的含量为0.1~1 wt%时，细胞黏附率的最大增幅（比g-HAP/PLGA高131.2~157.1%）仅在细胞接种后0.5小时观察到。术后24周，所有用植入物修复的缺损均已桥接，但含RGD共聚物的复合材料的新骨形成更多，融合界面更好。含RGD共聚物的复合材料促进了骨向内生长，但编织骨较多。RGD共聚物与骨形态发生蛋白2（BMP-2）的联合应用表现出最佳的骨愈合质量，因此被推荐为使用RGD肽的最佳策略。

[Abstract] Various surface modification methods of RGD (Arg-Gly-Asp) peptides on biomaterials have been developed to improve cell adhesion. This study aimed to examine a RGD-conjugated copolymer RGD/MPEG-PLA-PBLG (RGD-copolymer) for its ability to promote bone regeneration by mixing it with the composite of poly(lactide-co-glycotide) (PLGA) and hydroxyapatite nanoparticles surface-grafted with poly(l-lactide) (g-HAP). The porous scaffolds were prepared using solvent casting/particulate leaching method and grafted to repair the rabbit radius defects after seeding with autologous bone marrow mesenchymal cells (MSCs) of rabbits. After incorporation of RGD-copolymer, there were no significant influences on scaffold’s porosity and pore size. Nitrogen of RGD peptide, and calcium and phosphor of g-HAP could be exposed on the surface of the scaffold simultaneously. Although the cell viability of its leaching liquid was 92% that was lower than g-HAP/PLGA, its cell adhesion and growth of 3T3 and osteoblasts were promoted significantly. The greatest increment in cell adhesion ratios (131.2–157.1% higher than g-HAP/PLGA) was observed when its contents were 0.1–1 wt % but only at 0.5 h after cell seeding. All the defects repaired with the implants were bridged after 24 weeks postsurgery, but the RGD-copolymer contained composite had larger new bone formation and better fusion interface. The composites containing RGD-copolymer enhanced bone ingrowth but presented more woven bones than others. The combined application of RGD-copolymer and bone morphological protein 2 (BMP-2) exhibited the best bone healing quality and was recommended as an optimal strategy for the use of RGD peptides.

1. 引言

　　近年来，越来越多的研究者将兴趣集中在生物活性羟基磷灰石（HA）陶瓷及其复合材料作为骨修复材料上，因为它们具有良好的骨结合性能和骨传导性［1,3］ 。HA在化学和结构上与天然骨的矿物相相似，已被广泛应用于牙科和骨科手术中，用于填充骨缺损和涂覆金属植入物表面。与HA陶瓷相比，纳米级HA与聚酯（如聚乳酸（PLA）［4,5］、聚ε-己内酯（PCL）［6］和共聚物聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA）［1,7］的复合材料因其改善的力学性能、生物可降解性和可加工性，有望成为骨移植材料［8 ］。其中，HA/PLGA纳米复合材料在骨修复应用中更具吸引力，因为可以通过改变乳酸与乙醇酸的比例来调节PLGA的降解速率，以匹配骨形成的速率［7,9,10］。 然而，这些复合材料的细胞黏附能力有限，这将成为其在组织工程和骨科应用中的障碍。

　　细胞粘附是聚合物支架中一个初始且重要的细胞过程，因为它直接影响随后成骨细胞的生长、分化和迁移，进而促进骨组织的形成［11 ］。通常，细胞行为及其与生物活性材料表面的相互作用取决于物理和化学特性，如表面形貌、表面电荷和化学性质［12 14］。 三肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp，或RGD）是一种通过与整合素受体结合而积极促进细胞粘附的氨基酸序列［15,16 ］。它是许多细胞外基质蛋白和血液蛋白中发现的最小的细胞可识别序列，由Pierschbacher和Ruoslahti于20世纪80年代首次报道［17 ］。自此以后，人们已对多种固定有RGD或含RGD肽的聚合物进行了研究［18,19］。 其中大多数是通过化学或物理方法进行表面改性，并显示出改善的细胞粘附性。

　　多项研究表明，将粘附性RGD肽固定在材料表面可增强成骨细胞的粘附［20 22 ］。这种粘附特性归因于所有细胞粘附现象中存在的整合素受体。Kantlehner等人［22］在兔模型中研究了涂有环状RGD肽Cyclo(RGDfK)的多孔聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）植入物促进骨再生的能力，结果表明松质骨向内生长得到增强和加速，且新形成的骨直接与植入物表面接触。然而，Hennessy等人［23］报告称，涂有RGD的羟基磷灰石（HA）圆盘显著抑制了总骨形成以及直接与植入物周边接触的新骨量。推断其原因在于，羟基磷灰石陶瓷在吸附促粘附蛋白方面特别有效，这可能有助于羟基磷灰石的高骨传导性［23,24］ 。羟基磷灰石上直接表面修饰RGD肽被认为会与吸附的蛋白竞争整合素受体，从而对植入物整合产生负面影响。另一方面，即使采用化学方法固定在可生物降解聚合物表面的RGD肽，一旦外层材料生物降解，这些肽也容易被吸收并失去其功能。

　　为避免这一问题，本研究探讨了一种在透明质酸（HA）生物材料中使用RGD肽的新策略。我们合成了一种可生物降解的RGD偶联三嵌段共聚物［25］，并将其引入到HA/PLGA纳米复合材料中，以制备用于骨组织工程的3D多孔支架。复合材料中的共聚物和HA纳米颗粒有望分别在成骨细胞的粘附和生物矿化中发挥作用。根据我们之前的研究，该共聚物表现出一些优势，如可调的力学性能、可调的可降解性能以及可控的细胞粘附性。在PLGA中加入5%的共聚物后，3T3细胞系和人软骨细胞的细胞粘附性和活力显著提高［25］。同时，在本研究中，我们将共聚物与骨形态发生蛋白2（BMP-2）联合使用，以考察它们的协同作用。

2. 实验部分

2.1. 材料。L-丙交酯（LA）和乙交酯（GA）购自荷兰Purac公司。辛酸亚锡（Sn(Oct)2）购自Sigma公司。分子量为750的单甲氧基聚乙二醇（PEG750）购自Aldrich公司。使用前，通过甲苯共沸蒸馏进行干燥。γ-苄基-L-谷氨酸的N-羧酸酐（NCA）（BGL；BGL-NCA）根据Daly的方法［26］制备。N-叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸（Phe-BOC）、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和二环己基碳二亚胺（DCC）购自GL Biochem Ltd.（中国上海），直接使用。

　　从Acros获得的4-(二甲基氨基)吡啶（DMAP，纯度99%）和从CL Bioscientific股份有限公司（中国西安）购买的RGD（精氨酸-甘氨酸-（天冬酰胺））均未经进一步纯化直接使用。己烷、二氯甲烷和氯仿在CaH2存在下回流，并在氮气下蒸馏。四氢呋喃（THF）在使用前在钠存在下干燥并蒸馏。N,N-二甲基甲酰胺（DMF）在CaH2存在下干燥，并在使用前蒸馏。其他化学试剂均为分析纯，未经进一步纯化直接使用。

2.2. 聚合物合成。本实验室通过在Sn(Oct)2催化剂存在下，乳酸（LA）和乙交酯（GA）的开环共聚反应（ROP）合成了聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）（LA/GA=80:20，粘均分子量Mv=1.96×10^5）［7］。 根据我们已发表的方法，制备了钙（Ca）/磷（P）原子比约为1.67的羟基磷灰石纳米颗粒（HAP）及其表面接枝聚L-乳酸（PLLA）的产物（g-HAP）［4,7 ］。通过热重分析确定，g-HAP表面接枝的聚合物量为5.0±5.5重量百分比。

　　聚乙二醇-嵌段-聚L-丙交酯-嵌段-聚L-谷氨酸（PEGPLA-PGL/RGD）是根据我们之前的工作［25］，通过以下三个步骤简要合成的（方案1）：（1）以聚乙二醇-羟基（PEG-OH）为宏观引发剂，辛酸亚锡（Sn(Oct)2）为催化剂，通过乳酸（LA）的开环聚合（ROP）制备二嵌段共聚物PEG-PLA-OH，并将其羟基端基转化为氨基（NH2），得到PEG-PLA-NH2；（2）以PEG-PLA-NH2为宏观引发剂，通过来源于谷氨酸苄酯（BGL）的N-羧酸酐（NCA）的ROP制备三嵌段共聚物PEG-PLA-PBGL，27然后通过催化加氢去除PEG-PLA-PBGL中的保护性苄基，得到具有游离侧羧基的PEG-PLA-PGL；（3）借助N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、二环己基碳二亚胺（DCC）和4-二甲基氨基吡啶（DMAP），将RGD连接到侧羧基上。透析后，通过氨基酸分析中甘氨酸和精氨酸的含量测定，所得PEG-PLA-PGL/RGD（RGD共聚物）中RGD的偶联率为39~49重量百分比。

2.3. 纳米复合材料的制备。通过将g-HAP/氯仿悬浮液均匀分散到10% PLGA/氯仿溶液中，在磁力搅拌下过夜，并超声处理30分钟，制备了复合材料g-HAP/PLGA（HP）。复合材料中g-HAP的含量为10 wt%。将RGD共聚物溶解于DMF中，并分散到HP氯仿溶液中，通过磁力搅拌2小时和超声处理30分钟，制备了RGD共聚物/g-HAP/PLGA（RHP）复合材料。最后，将人BMP-2（北京百灵科生物科技有限公司，中国）分散到RHP溶液中，制备了BMP-2/RGD共聚物/g-HAP/PLGA（BRHP）复合材料。复合材料中RGD共聚物和BMP-2的含量分别为1.0 wt%和0.4 wt%。本研究中的复合支架实验组如表1所示。

2.4. 多孔支架制备。根据我们之前的工作，采用溶剂浇注/颗粒浸出法制备多孔支架［8］。 将通过筛网获得的直径为100~450μm的蔗糖颗粒混合到HP、RHP和BRHP的10%氯仿溶液中，蔗糖/复合物的质量比为6:1（w/w）。将混合物浇注成玻璃圆盘，并在空气中干燥3天。随后，通过将复合物在蒸馏水中浸出5天（每12小时更换一次水）来从复合物中去除蔗糖颗粒，然后在空气和真空下干燥复合物。上述过程在4℃下进行。然后将获得的多孔复合支架切成小条（3×5×20mm），用紫外线照射灭菌30分钟。

2.5. 支架表征。使用发射扫描电子显微镜（ESEM；Philips XL30 ESEM FEG，日本）观察支架的微观结构。使用NIH Image J软件测量总共400个孔的直径，每个孔的材料直径。采用能量色散X射线光谱仪（EDX；Philips，XL-30W/TMP，日本）对表面元素的组成进行了分析。根据已发表的方法，使用无水乙醇通过改良的液体置换法测量支架的孔隙率［28 ］。获得了支架的开孔率，并对每种材料进行了三次测量以获得平均值。

2.6. 细胞评估。细胞培养。NIH 3T3细胞（小鼠胚胎成纤维细胞系）购自中国科学院上海细胞生物研究所（CAC），在含有10%胎牛血清（FBS，Gibco）、1.0×10^5 U/L青霉素（Sigma）和100 mg/L链霉素（Sigma）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco）中培养。成骨细胞采用改良的骨块培养方法，从新生兔的颅骨中分离得到［29］。简而言之，在无菌条件下解剖颅骨。去除骨膜和骨内膜后，将颅骨切成小块（2×2×2 mm），置于组织培养皿中静置15分钟。向培养皿中加入5 mL含10% FBS、10 mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N0-(2-乙磺酸)钠盐（HEPES，Sigma）、1.0×10^5 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM，并在含有5% CO2、37℃的加湿培养箱中培养24~48小时。然后每两天用10 mL培养基更换一次培养皿中的培养液。在3T3细胞和成骨细胞达到70%-80%融合度时，进行以下评估。

　　细胞粘附与铺展。根据我们已建立的方法，通过在复合材料的薄膜上接种NIH 3T3细胞来进行细胞粘附评估［30］。 简而言之，准备24个24毫米的硅化盖玻片，用2%二甲基二氯硅烷（DMDC，Fluka）处理并在180℃下烘烤4小时。将样品分别溶解在氯仿中，浓度为1%。将50微升溶液转移到盖玻片上，通过在空气中蒸发30分钟和在真空干燥器中室温下干燥48小时形成薄膜。然后，用紫外线对盖玻片进行30分钟的灭菌处理，并将其置于六孔组织培养板（TCPs，Costar）中。向孔中加入3毫升培养基，以防止细胞接种时盖玻片漂浮。将1.0×10^5个3T3细胞（在1毫升培养基中）接种到每个孔中，并将培养板置于37℃、5% CO2的环境下培养。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤盖玻片三次，并在室温下用含3%戊二醛的PBS固定30分钟。用PBS洗涤三次后，用一滴甲苯胺蓝染色剂对细胞进行染色30分钟，用蒸馏水洗涤，并在空气中干燥。在倒置显微镜（TE2000U，Nikon）下观察细胞附着情况和细胞形态。为了获得HP复合材料中RGD共聚物的最佳含量，在支架制备前制备了不同RGD共聚物含量（0.1%、0.5%、1%、5%和10%；w/w）的HP和RHP复合材料薄膜，并接种NIH 3T3细胞。在细胞接种后0.5至3小时，对每个视野中的细胞数量进行计数。

　　材料提取液的细胞毒性测定。通过用培养基提取聚合物材料，并在提取液存在下进行3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴盐（MTT）试验，评估材料对成骨细胞的细胞毒性。将复合材料切片浸入培养基（每20平方厘米材料表面积10毫升DMEM）中，在37℃下浸泡48小时，以获得浸出液，据信此时毒性成分的主要部分已被提取出来。然后将浸出液分别稀释至原体积的1倍、2倍和4倍。将传代2次和3次的成骨细胞接种到96孔TCPs中，密度为1×10^4个细胞/200微升/孔，并在200微升DMEM中于37℃、5% CO2气氛下孵育。48小时后，将孔中的培养基替换为200微升/孔的浸出液。每种液体样本使用六个重复孔。

　　共孵育20小时后，向每个孔中加入20 μL MTT（Sigma，5 mg/mL溶于PBS中），再孵育4小时。移除培养基，用150 μL DMSO替换。以200 rpm的速度振荡培养板15分钟，以溶解形成的甲胺盐晶体，并用Thermo Electron MK3 μm在492 nm处进行测量。细胞活力以同一培养基中TCPS吸光度值的比例表示。

　　细胞活力。还采用MTT法测量了多孔支架上兔成骨细胞的细胞活力，以定量评估附着并生长在基质表面的活细胞数量。制备多孔支架圆盘（直径5.5毫米，厚度2毫米），经紫外线消毒30分钟后放入96孔TCP中。孔底表面完全被圆盘覆盖。每种材料在四个平行孔中重复实验。未放置材料盘的TCP孔作为对照组。然后，将收获的成骨细胞接种到96孔TCP中，每孔接种密度为5×10^4个细胞，加入200 μL培养基，于37℃、5% CO2条件下孵育3天和7天。每2天更换一次培养基。在每个时间间隔，向每个孔中加入20 μL MTT（5 mg/mL溶于PBS中），于37℃、5% CO2条件下孵育4小时。

移除培养基，用0.2 mL 0.04 M盐酸的异丙醇溶液替换，以溶解已转化的染料。将每个孔的溶液（150 μL）混合后转移到另一个96孔板中，使用Thermo Electron MK3 μm在540 nm处测量已转化染料的吸光度值。相对增殖率（RPR）的计算方法为：试验孔吸光度/对照孔吸光度。

　　流式细胞术（FCM）分析细胞周期。使用流式细胞仪（FCM，FACS Calibur，BD，美国）分析在不同材料薄膜上培养的成骨细胞的细胞周期。将复合材料在氯仿中的溶液（1 wt%）分别涂覆在预先用DMDC处理的玻璃盘（直径75 cm）上，30然后将涂覆后的玻璃盘干燥并用紫外线灭菌。每种材料制备三个玻璃盘作为平行样本，每个样本间隔一定时间。使用未经任何处理的玻璃盘作为对照。将获得的2-4代成骨细胞以2×10^4个细胞/cm^2的密度接种到盘上，并在37℃、5% CO2的加湿培养箱中孵育。每2天更换一次培养基。在3天和6天的时间间隔收集细胞，并用75%（v/v）的冷乙醇固定。将每种材料三个平行盘上的细胞收集在一起作为样本进行FCM分析。在每个时间间隔，分别评估至少1×10^6个成骨细胞在不同材料上生长的细胞周期比例和凋亡情况。

2.7. 动物实验。自体骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离与扩增。根据参考文献［31］中描述的改良程序，从兔骨髓中分离、培养并扩增MSCs。本研究共使用了16只16周龄、体重2.96±0.25 kg的青春期兔子。采用随机方法选择一半兔子用于植入组织工程植入物，另一半用于植入无细胞支架。对用于植入组织工程植入物的兔子进行0.3%戊巴比妥钠麻醉，并在右后肢胫骨上部用注射器抽取2.0 mL骨髓，注射器需预先用1%新鲜肝素湿润。每只兔子的骨髓立即注入含有25 mL无血清培养基的50 mL试管中，完全分散，并在1000 rpm下离心5分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗三次。将获得的细胞重悬于补充有10%胎牛血清（FBS）、50 mg/L抗坏血酸（Sigma）、10 mM HEPES、1 μg/L碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Gibco）、50 μg/L胰岛素（Sigma）、1.0×10^5 U/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM中，并以8 mL吸量/cm^2的密度接种于组织工程板（TCPs）中，置于37℃、5% CO2的加湿培养箱中。培养4天后去除未贴壁的造血细胞，用培养基轻轻清洗培养板。此后，每两天更换一次培养基。在细胞融合前，使用0.25%胰蛋白酶（Gibco）/0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）分离原代MSCs，并以2×10^4个细胞/cm^2的密度重新接种。细胞传代3至4次，直至每只兔子的MSCs总数增殖至超过5×10^6个细胞，以用于组织工程构建。

　　利用自体间充质干细胞（MSCs）制备组织工程植入物。使用胶原水凝胶作为载体，将骨髓间充质干细胞（MSCs）接种到HP、RHP和BRHP多孔复合支架的条状物（宽3毫米，长20毫米）上。通过在4℃下将10毫克牛胶原蛋白（根据参考文献32从牛跟腱中提取）溶解在20毫升0.1%醋酸溶液中，制备了0.5重量百分比的牛胶原蛋白溶液。在冰上用1 M冷NaOH将溶液的pH值调节至7.0至7.2。随后，将1 mL溶液加入到装有兔子的1×10^7个骨髓间充质干细胞（MSCs）的试管中，并轻轻混合。将胶原蛋白/细胞混合物接种到两种不同材料中，并在37℃下孵育10至20分钟，直至支架中形成水凝胶。这些植入物在植入前继续在体外培养3天。

　　骨缺损修复的植入术。根据参考文献［8］和［33］，通过手术将HP、RHP和BRHP的无细胞支架和组织工程植入物移植到16只兔子的双侧临界大小桡骨缺损处。简而言之，在30 mg/kg戊巴比妥钠麻醉下，于兔子的双侧桡骨上制造长20 mm的骨缺损，并分别用无细胞支架或自体组织工程植入物进行替换。植入物的尺寸与兔子桡骨相似，无需任何固定即可放置于缺损区域。伤口以常规手术方式缝合。使用纯桡骨缺损作为对照组。动物饲养于吉林大学实验动物研究所，遵循实验动物护理和使用指南。

　　计算机断层摄影和组织学检查。术后24周时处死兔子，同时获取修复骨和相邻尺骨的活检组织，用于计算机断层摄影（CR，Kodak CR-400plus，美国）和组织学检查。经过CR检查后，将活检组织在4 wt%的缓冲多聚甲醛中固定6天，在37℃下用10%的EDTA脱钙3至4周，然后在递增浓度的乙醇中脱水，并包埋在石蜡中。使用显微切片机（Leika RM2145显微切片机，德国）将组织块切成5 μm厚的切片，并进行H&E染色、甲苯胺蓝染色和Masson三色染色，以进行光学显微镜观察。

2.8. 统计分析。所有定量数据均使用Origin 7.0（OriginLab Corporation，美国）进行分析，并以均值（标准差）表示。采用方差分析（ANOVA，Origin7.0）进行统计比较。p值<0.05被认为具有统计学意义。

3. 结果与讨论

　　尽管RGD被广泛认为能促进细胞/生物材料相互作用，但有报道称，直接对RGD肽进行表面修饰会对羟基磷灰石（HA）植入物的性能产生负面影响。23 RGD肽与已吸附的蛋白质竞争整合素受体，会降低成骨细胞在HA表面的初始附着和存活率。另一方面，由于RGD与HA的结合力较弱或HA溶解，RGD肽会从HA表面脱落。这些游离的RGD肽会反过来抑制细胞粘附。19 本研究旨在开发一种新型RGD偶联共聚物，作为掺入羟基磷灰石（HP）纳米复合材料中的组分，以促进细胞粘附，并应用于组织工程和骨再生。将RGD偶联物与γ-羟基磷灰石（g-HAP）/聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）复合物混合，预期RGD肽会在支架表面随时暴露，发挥其在细胞粘附和骨形成中的作用，直至材料在体内完全生物降解（如图2所示）。

3.1. 支架表征。

　　微观结构。采用溶剂浇注/颗粒浸出法制备组织支架，通过控制颗粒的尺寸和数量来调节孔径和孔隙率，以满足细胞向内生长和组织再生的需求，显示出其优势。多孔复合支架的扫描电子显微镜（SEM）图像如图1所示。支架高度多孔，孔隙不规则且相互连通。支架的孔隙率范围为86.3%至87.7%（表1）。高孔隙率（HP）、高孔隙率/颗粒（RHP）和生物活性玻璃/高孔隙率/颗粒（BRHP）的平均孔径分别为140.3（80.6）、132.1（87.3）和129.5（88.2）微米（表1）。尽管与HP相比，掺入RGD共聚物的支架似乎更加不规则，且直径小于50微米的微孔更多，直径在50至150微米之间的大孔也更多（图1g），但三组支架在平均孔径和孔隙率方面无显著差异（p>0.05；表1）。原因推测是RGD共聚物具有两亲性，且复合材料中RGD共聚物和BMP-2的含量极低（分别仅为1.0%和0.4%重量百分比）。

　　表面特性。图2展示了支架中孔壁的表面形貌。由于掺入了g-HAP颗粒，所有复合支架均呈现出表面粗糙且均匀分布的点状颗粒。据认为，表面粗糙度可促进锚定依赖性成骨细胞的附着、增殖和分化。34 孔壁粗糙度在成骨效果以及大孔隙率（孔径>50μm）方面发挥着重要作用。35 三种支架孔壁表面暴露的g-HAP颗粒在尺寸或分布上无明显差异。

　　能谱分析（EDX）用于确定支架的表面元素组成（图3和表2）。氮（N）与碳（C）的原子比可以定量衡量材料表面接枝的RGD肽和BMP-2的量，因为氮仅存在于RGD共聚物中，而BMP-2仅存在于这些复合材料中。如表2所示，RGD共聚物的N/C比为0.148。该比值从羟基磷灰石（HP）的0.037略微增加到掺入RGD共聚物（复合材料中RGD共聚物的质量分数为1%）的复合材料的0.045至0.046，表明这两种复合支架上确实存在RGD肽。

　　同时，所有复合支架均显示出高含量的钙（Ca）和磷（P）（见图3和表2），这是由于将羟基磷灰石（HA）颗粒掺入聚合物基质中所致。与羟基磷灰石（HP）相比，由于引入了RGD共聚物和骨形态发生蛋白-2（BMP-2），再生羟基磷灰石（RHP）和生物再生羟基磷灰石（BRHP）中钙和磷的含量略有下降（见表2）。

　上述结果表明，RGD肽、钙（Ca）和磷（P）可以同时暴露在支架表面，因为本研究中的材料体系是通过将RGD共聚物掺入g-HA/PLGA复合物中制备的。

3.2. 复合材料中RGD共聚物含量对细胞黏附的影响。为了确定羟基磷灰石（HP）复合材料中RGD共聚物的最佳含量，我们研究了不同RGD共聚物含量的HP和RHP复合材料薄膜上NIH 3T3细胞的黏附情况。图4显示，在0.5小时时，所有RHP复合材料上的细胞密度均显著高于HP（p < 0.05）。RGD共聚物含量为0.1%、0.5%和1%的复合材料表现出较高的细胞黏附率，且细胞黏附率增幅最大（比HP高出131.2%至157.1%），但这仅在细胞接种后0.5小时时观察到。当RGD共聚物含量增加至5%以上时，细胞密度显著降低。培养1小时后，HP和RHP复合材料之间的细胞密度差异缩小。培养3小时时，尽管HP上的细胞附着量大幅增加，但1% RHP上的细胞密度仍显著高于HP和10% RHP。这表明，适量掺入RGD共聚物可促进细胞快速黏附。因此，本文选择1% RHP用于支架制备及其后续研究。

3.3. 材料提取液的细胞毒性。图5a显示了通过MTT法评估的各种复合材料浸提液对成骨细胞的细胞毒性作用。与培养基相比，所有浸提液均未表现出明显的细胞毒性，因为原始浸提液的细胞活力在92.0%至117.3%之间，稀释2倍后的细胞活力在102.9%至114.1%之间，稀释4倍后的细胞活力在100%至109.5%之间。羟基磷灰石（HP）的细胞活力比对照组高15.7%，在稀释2倍和4倍时仅略有下降。张等人评估β-磷酸三钙（β-TCP）对L929成纤维细胞的细胞毒性作用时也报告了类似的结果，36表明羟基磷灰石（HA）或β-TCP陶瓷中的某些成分似乎对细胞活力有益。尽管在稀释前，复合RHP的细胞活力（92.0±7.0%）相对低于其他两种支架（p<0.05），但随着稀释倍数的增加，其细胞活力可提高至100±102.9%。与RHP相比，BRHP在初始浓度下的细胞活力显著提高（p < 0.05），且与HP相似。结果表明，本研究制备的三种复合材料对成骨细胞无毒性，可用于细胞生长或组织工程。

3.4. 复合支架上的细胞增殖。图5b显示了采用MTT法分析的，在HP、RHP和BRHP多孔支架上培养3天和7天后，与TCP上的细胞相比，兔成骨细胞的相对增殖率（RPR）。体外培养3天后，RHP和BRHP的RPR高于HP，且BRHP与HP之间存在统计学差异（p < 0.05）。体外培养7天后，三种复合支架上成骨细胞的RPR均明显下降。其中，与3天培养相比，HP和BRHP的RPR下降了近一半。RHP支架的RPR显著高于HP（p < 0.05）。然而，BRHP与其他两种复合材料之间无显著差异。据推断，RGD共聚物促进了成骨细胞的粘附和增殖，而BMP-2与RGD共聚物的组合在早期增强了细胞增殖，但在后期减弱了细胞增殖。换言之，作为骨形成中的主要生长因子之一，BMP-2的主要功能是诱导成骨细胞分化为骨细胞并加速骨基质形成，而非促进成骨细胞本身的增殖。37