［重点文章推送］贻贝仿生介导生长因子IGF-1修饰的HA/PLGA微载体用于细胞扩增和成骨分化（Macromol Biosci, 2015）

中英文摘要

摘要：在本研究中，胰岛素样生长因子1（IGF-1）通过聚多巴胺（pDA）成功固定在聚乳酸-羟基乙酸共聚物/羟基磷灰石（PLGA/HA）和纯PLGA微载体上。结果表明，pDA层能在20分钟内简单高效地将肽固定在微载体上。小鼠脂肪来源干细胞（ADSCs）在IGF-1固定微载体上的附着和增殖明显高于未固定的微载体。更重要的是，IGF-1固定的PLGA/HA微载体显著提高了ADSCs的碱性磷酸酶（ALP）活性和成骨相关基因的表达。因此，认为IGF-1修饰的PLGA/HA微载体在骨组织工程中将具有巨大价值。

Abstract

1 引言

　　骨缺损可由创伤、肿瘤切除、感染和骨骼异常引起，因此对骨移植物（包括自体移植物、同种异体移植物和异种移植物）的需求巨大，这些移植物已广泛应用于骨修复［1, 2］。 尽管部分移植物对骨再生有效，但许多缺点限制了其发展，如免疫反应、可用性有限、病原体传播和非生物降解性［3］。 同时，通过单独或联合使用成骨细胞、骨诱导生长因子和支架，似乎是骨修复和再生现有疗法中最有前景的替代方案［4］ 。其中最重大的挑战之一是设计和制造一种可直接用于骨修复的仿生细胞负载支架。

　　近年来，由可生物降解聚合物组成的微载体受到了广泛关注［5, 6］，如聚乳酸（PLA）、7聚乙醇酸（PGA）及其共聚物聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA），因为这些聚合物具有良好的机械性能、低免疫原性和毒性，以及可调节的降解速率［8, 9］。可生物降解微载体不仅为细胞治疗领域提供了大量细胞，而且无需酶处理和收获，即可直接作为微载体/细胞复合物应用于组织和器官［3, 9］。 PLGA是组织工程中最有前景的可降解材料之一，因为其降解速率可通过改变乳酸与乙醇酸的比例来调节［10］。然而，其疏水性质和生物活性的缺乏严重限制了其在生物学中的应用。羟基磷灰石（Ca10(PO4)6(OH)2, HA）是一种有效的仿生材料成分，因其与天然骨的矿物相相似，具有骨结合和骨传导能力，已被广泛应用于骨组织工程［11］。考虑到微载体具有良好的流动性，可作为三维支架注射到各种形状的骨缺损中进行骨修复，PLGA/HA复合微载体可能比预成型支架提供更多样化的应用［3］。

　　此外，微载体在负载生长因子、肽或药物等时，能够诱导干细胞分化。用生长因子或其他生物活性分子进行修饰，可以弥补合成聚合物成骨潜力的不足［12 ］。胰岛素样生长因子1（IGF-1）作为骨折愈合中的治疗因子，无论是单独使用还是与其他生长因子联合使用，都引起了人们的兴趣［13-15］。 IGF-1，如同生长调节素C和生长调节素A，是一种促有丝分裂因子，可促进成体细胞的生长，并有助于胚胎的生长和分化［16］ 。研究表明，IGF-1可促进间充质干细胞的增殖，并逆转植入物对成骨分化的抑制作用［17］ 。此外，掺入IGF-1和TGF-β的聚乳酸可显著加速大鼠骨折愈合，且无全身性副作用［18 ］。但关于透明质酸（HA）和IGF-1对骨组织工程的联合作用，相关报道较少。据推测，如果我们采用某些方法将IGF-1固定在微载体上，那么固定了IGF-1的微载体不仅有助于所需细胞的增殖，还有助于细胞的骨诱导作用。

　　受贻贝粘附机制的启发，最近通过简单地将基材浸入碱性多巴胺（DA）溶液中，创建了一种多功能的聚多巴胺（pDA）涂覆方法[19]。在碱性环境中，DA中的邻苯二酚基团被氧化，在多种有机和无机材料（如聚合物、金属和金属氧化物）上形成pDA吸附层[20-22]。与其他通常需要多步骤、复杂程序（如氧等离子体预处理[23]、辐照[24]、化学物质[25]或表面活化[4]）的化学共轭方法相比，该方法更为简单。据报道，材料表面的pDA涂层可分为两步。首先，DA在碱性溶液中发生氧化和重排，生成5,6-二羟基吲哚，这是下一步聚合的单体[26]。在此反应后，氨基（-NH2）发生环化，聚合物中的羟基（-OH）保留[27, 28]。众所周知，含羟基的化合物总是会释放氢离子，使母体化合物呈酸性。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和羟基磷灰石（HA）的功能基团（即-CO-、-OH）有助于诱导物质表面发生DA聚合，并进一步促进形成均匀的pDA涂层。[26]有趣的是，已证明pDA涂层可通过增加血清粘附蛋白的固定来促进某些细胞类型在各种表面的粘附[29]。我们推测，这种简单技术适用于将生物活性因子（如胰岛素样生长因子-1，IGF-1）共轭到PLGA微载体上，以制备功能性可生物降解微载体。

　　本研究旨在探讨通过聚多巴胺（pDA）涂层固定胰岛素样生长因子-1（IGF-1）后，聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）/羟基磷灰石（HA）微载体的生物活性和骨诱导性是否得到增强。微载体通过油包水（O/W）乳化法制备，并在微载体上涂覆pDA以固定IGF-1。采用CCK-8法和细胞骨架染色法测定脂肪来源干细胞（ADSCs）在功能性微载体上的附着和生长促进作用。随后，通过碱性磷酸酶（ALP）活性和定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）来探究微载体的骨诱导作用。

2 实验部分

2.1 材料

　　聚乳酸-羟基乙酸共聚物（丙交酯/乙交酯比例=80/20，分子量=85,000）由中国科学院长春应用化学研究所（CIAC，中国）合成。聚乙烯醇（PVA，醇解度99.8–100%（摩尔/摩尔））购自阿拉丁化学有限公司。二氯甲烷（DCM）购自北京化工厂。重组人胰岛素样生长因子-1购自优宝生物技术有限公司。3-羟基酪胺盐酸盐购自阿达玛斯试剂有限公司。

2.2 PLGA/HA微载体的制备

　　如我们之前的工作所述，合成了HA纳米颗粒。30 然后，按照以下步骤制备PLGA/HA微载体。将0.07克HA分散在1毫升DCM中，将0.63克PLGA溶解在9毫升DCM中。随后，将HA悬浮液滴入PLGA溶液中，并以500转/分的速度搅拌24小时。HA的总固体含量为10%（w/w）。将最终混合物倒入以400转/分的速度快速搅拌的PVA溶液（150毫升，2%（w/v））中，然后搅拌过夜以使溶剂蒸发。将PVA溶液倾析掉，用蒸馏水洗涤微载体三次。在相同条件下也制备了纯PLGA微载体。

2.3 pDA涂层与IGF-1固定化

　　pDA涂层按以下步骤进行。将PLGA/HA微载体和PLGA微载体浸入DA溶液（2 mg·mL−1，溶于10 mM Tris-HCl，pH 8）中，并在室温下置于摇床上2小时（pDA @ PLGA/HA和pDA @ PLGA）。随后，用蒸馏水冲洗涂有pDA的微载体五次，以去除未附着的DA分子。之后，将IGF-1固定到pDA @ PLGA/HA和pDA @ PLGA上（pDA @ PLGA/HA/IGF-1和pDA @ PLGA/IGF-1）。将涂有pDA的微载体（每组50 mg）浸入不同浓度（1、10和100 ng·mL−1）的IGF-1溶液（10 mL）中，在室温下浸泡20分钟。随后，用蒸馏水洗涤微载体三次，以去除未附着的肽。

2.4 微载体分析

　　使用扫描电子显微镜（SEM，XL30 ESEM-FEG，FEI）观察微载体的形态和表面形貌。将微载体样品进行冷冻干燥，用双面胶固定在金属载网上，并涂覆铬。结合能量色散X射线光谱（EDX）与SEM，对矿物晶体进行元素分析。

采用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR，Perkin Elmer，FTIR-2000）测定微载体在浸泡于pDA溶液前后化学结构的变化。

2.5 溶菌酶的固定化

　　溶菌酶因其碱性等电点接近胰岛素样生长因子-1（IGF-1），被选为模型蛋白，以测定合成微载体的吸附动力学和吸附效率。通过旋转器使聚多巴胺（pDA）涂覆的微载体与溶菌酶水溶液相互作用。简而言之，将50 mg微载体与10 mL溶菌酶溶液（2 mg·mL−1）在150 rpm的搅拌下孵育1小时。使用醋酸盐和磷酸盐缓冲系统在自身缓冲范围内调节培养基的pH值，使其在5.0~9.0范围内变化。然后评估5~60分钟相互作用时间对吸附容量的影响。通过BCA试剂盒测定样品中溶菌酶浓度的降低，从而确定吸附的溶菌酶浓度。

2.6 细胞培养

　　按照既定方案，从中国长春吉林大学提供的BALB/c小鼠（SCXX（JING）2009-0015）脂肪组织中分离出脂肪源性干细胞（ADSCs）。这些小鼠的处理遵循《美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南》。

简而言之，首先在分离筛上提取组织并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后在37°C下用0.075%的I型胶原酶（Gibco）处理1小时，期间不断摇动。随后，在1200转/分钟、4°C的条件下离心10分钟收集细胞，并将细胞与含有10%胎牛血清（Gibco）、100 U·mL−1青霉素和100 U·mL−1链霉素（Sigma）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco）一起接种到组织培养瓶中。细胞贴壁后，移除培养基，用PBS洗涤，并更换为新鲜培养基。将细胞培养至80%融合，然后传代以进行细胞扩增。本研究中的实验使用的是第2或第3代的脂肪源性干细胞（ADSCs）。

2.6.1 细胞增殖

　　将微载体（纯微载体、涂有聚二烯丙基二甲基氯化铵（pDA）的微载体和固定有胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的微载体）浸入70%酒精中30分钟进行灭菌。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次后，浸入细胞培养基中过夜，然后将其置于24孔板中（每孔20毫克），以覆盖孔底。每孔接种1毫升脂肪间充质干细胞（ADSCs）悬液（浓度为3×10^4毫升−1）。将培养板置于37℃、5% CO2加湿环境中培养，每2天更换一次培养基。培养4天和7天后，用细胞计数试剂盒-8（CCK-8，日本Dojindo公司）替换培养基。孵育2小时后，使用多功能微孔板扫描仪（Tecan Infinite M200）测量450纳米和600纳米的吸光度值。

2.6.2 共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）

　　通过CLSM分析研究细胞形态和定植/增殖情况。从孔板中取出细胞/微载体样本，用PBS溶液冲洗两次，然后在室温下用4%多聚甲醛固定10分钟。用PBS溶液洗涤三次后，将样本在含0.25% v/v Triton X-100的PBS溶液中孵育5分钟。然后，在室温下孵育细胞/微载体结构30分钟，用稀释在BSA/PBS（1% w/v）中的鬼笔环肽四甲基罗丹明B异硫氰酸酯（Invitrogen）对肌动蛋白微丝进行染色。使用4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Invitrogen）进行细胞核检测。将DAPI储备液稀释在BSA/PBS中，将微载体/细胞样本在室温下孵育2分钟。然后用PBS溶液洗涤微载体/细胞样本三次，并通过CLSM（Zeiss LSM 780）进行观察。

2.6.3 碱性磷酸酶活性检测

　　使用对硝基酚磷酸盐底物（pNPP）溶液（Sigma）通过测量产生的对硝基酚的量来评估孵育4天和7天的脂肪源性干细胞（ADSCs）的碱性磷酸酶（ALP）活性。简而言之，在孵育结束时，小心移除每个孔中的培养基。然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤ADSCs三次，并在RIPA缓冲液中裂解，然后在-80°C下冷冻30分钟，并在37°C下解冻。在黑暗中向每个孔中加入50μL的pNPP溶液，并在37°C下孵育30分钟。使用多功能微孔板扫描仪读取405nm处的吸光度。平均光密度（OD）值用于相应地反映ALP活性水平。

2.6.4 定量实时聚合酶链反应

　　在不同微载体上培养的脂肪源性干细胞（ADSCs）在7天后进行孵育，并使用qRT-PCR技术定量评估成骨相关基因的mRNA表达。根据制造商的协议，使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA。使用Nanodrop Plates（Tecan Infinite M200）测定RNA的浓度和纯度，并使用带gDNA Eraser的PrimeScript RT试剂盒（Perfect Real Time，TaKaRa）进行逆转录。成骨标志物的表达通过qPCR SYBR Green Mix Kit（TaKaRa）进行定量。使用beacon 5.0的引物设计软件设计包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、抗runt相关转录因子2（RUNX2）和骨桥蛋白（OPN）在内的基因特异性引物（表1）。qRT-PCR通过StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems，CA）进行，表达水平通过iCycler iQ Detection System软件确定的阈值循环（Ct）获得。使用ΔΔCt法计算相对转录量。以GAPDH基因作为参考基因，与来自相同cDNA样本的目标基因一起扩增。样本mRNA相对于GAPDH mRNA的Ct差值定义为ΔCt。对照细胞ΔCt与微载体上细胞ΔCt的差值定义为ΔΔCt。mRNA表达的倍数变化以2−ΔΔCt表示。